不同产地雷公藤中4种有效成分的含量测定

张玉梅 曹佩雪 张仕林

摘要 [目的]建立同时测定雷公藤中4种有效成分含量的方法，并研究不同产地雷公藤中4种有效成分的含量差异。[方法]采用Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱;以乙腈-0.1%磷酸-0.2%三乙胺溶液为流动相，梯度洗脱;检测波长：0～65 min为225 nm，65 min后为210 nm;流速0.75 mL/min;柱温25 ℃;进样量10 μL。[结果] 4种有效成分均有较好的分离度，方法精密度和重复性RSD均小于3.7%，待测样品于室温下24 h内能保持稳定，4种有效成分均有良好的线性关系，加样回收率分别为雷公藤甲素86.72%、雷公藤内酯酮107.51%、雷公藤红素76.94%、雷公藤酯甲84.38%。[结论]该方法精密度和重现性良好，可同时测定雷公藤中4种有效成分的含量，可为雷公藤的质量控制提供科学依据。

关键词 雷公藤;有效成分;HPLC;含量测定

Abstract [Objective]To establish a method for simultaneous determination of four effective ingredients of Tripterygium wilfordii，and to study the difference of these four effective constituents from different producing areas.[Method]Samples were analyzed on a Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim chromatographic column （ 250 mm × 4.6 mm，5 μm ）， and eluted with the mobile phase of acetonitrile - 0.1% phosphorus -0.2% triethylamine solution with a linear gradient mode， the detection wavelengths were set at 225 nm for 0-65 min and 210 nm for 65 min， the flow rate of the mobile phase was 0.75 mL/min with the column temperature of 25 ℃， and the determined volume was 10 μL.[Result]These four effective constituents were well separated， the RSD of precision and repeatability both less than 3.7%， and the samples remained stable for 24 hours at room temperature.Meanwhile these four effective constituents exhibited a good linearity， and the recoveries of triptolide， triptonide， celastrol and wilforlide was 86.72%， 107.51%， 76.94% and 84.38%，respectively.[Conclusion]The method is accurate and repeatable， and it can be used for the determination of the four components in Tripterygium wilfordii.

Key words Tripterygium wilfordii Hook.f.;Effective constituents;HPLC;Content determination

雷公藤药材系卫矛科雷公藤属植物的根，主产于浙江、湖南、江西、安徽、贵州等地[1]，具有抗炎、抗菌、免疫调节等多种药理作用，用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等[2]，临床应用广泛。雷公藤药材中主要活性成分为二萜内酯类，生物碱类及三萜类化合物[3-4]，但其主要活性成分同时又是毒性成分，不良反应时有报道[5-7]。目前，对于雷公藤药材的评价多集中于对主要有效成分雷公藤甲素或雷公藤红素的含量测定，但单一化学成分不能较全面反映药材质量，虽然梁健等[8]对雷公藤药材进行了HPLC指纹图谱的研究，但并未对药材中各个有效成分进行准确的定量。因此，该试验对雷公藤中4种有效成分同时进行测定，并对15批不同产地药材中有效成分的含量进行比较。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。Agilent 1260型高效液相色谱仪（包括DAD检测器、四元低压梯度泵、在线真空脱气机，美国Agilent公司）;Chemstation工作站（美国Agilent公司）;NE-203型电子天平（梅特勒-托利仪器有限公司）;XBF-500型高速中药粉碎机（吉首市中湘制药机械厂）;2XZ-4C型真空泵（临海市谭氏真空泵有限公司）;SB-2000型水浴锅（上海市爱朗仪器有限公司）;DL/SB-5/25型低温冷却循环泵（巩义市予化仪器有限责任公司）;SHB-III型循环水多用真空泵（北京市泰和格润仪器有限公司）;SK5200B型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.1.2 试剂。雷公藤甲素（批号GR-133-160613）、雷公藤内酯酮（批号GR-134160613）对照品购自南京广润生物制品有限公司，纯度≥98%;雷公藤红素（批号A0106）、雷公藤酯甲（批号A0107）对照品购自中国食品药品检定研究院，纯度≥98%。乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺均为色譜纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）;水为娃哈哈纯净水;其他试剂为分析纯，玻璃层析柱（内径1 cm），中性氧化铝（100 ～ 200目）。

1.1.3 试材。15批雷公藤药材来源见表1，其中S1 ～ S9购于贵阳太升中药材市场，S10 ～ S15于不同地方采集，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为雷公藤属植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）的根。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液的配制。精密称取适量对照品雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素、雷公藤酯甲，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得各对照品储备液。精密量取各对照品储备液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇并定容至刻度，混合，摇匀，精密量取1 mL混合液，稀释成10 mL，制备成混合对照品溶液。

1.2.2 雷公藤药材供试品溶液的配制[9-11]。S1 ～ S15雷公藤药材干燥粉碎后过40目筛，精密称取15 g，加入95%乙醇，其料液比为1∶3，75 ℃回流提取2次，每次4.5 h，过滤，合并滤液，浓缩至无乙醇味，干燥至恒重。精密称取干燥后的残渣0.5 g于锥形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL，超声处理30 min，过滤，用30 mL乙酸乙酯分次洗涤锥形瓶和漏斗，合并滤液及洗液，旋转蒸发仪回收溶剂，残渣用10 mL乙酸乙酯溶解，经过中性氧化铝柱（100 ～ 200目，3.5 g，内经1 cm，乙酸乙酯湿法装柱），用35 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，回收溶剂。残渣用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得各供试品溶液。

1.2.3 色谱条件。色谱柱：Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流动相A：0.1% 磷酸溶液-0.2% 三乙胺溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱（0 ～10 min，20%～35% B;10～15 min，35%～40% B;15～35 min，40% B;35～50 min，40%～45% B;50～60 min，40%～45% B;60～75 min，65%～75% B）;检测波长：0～65 min为225 nm，65 min时为210 nm;流速：0.75 mL/min;柱温：25 ℃;进样量：10 μL。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 系统适应性试验。分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，在“1.2.3”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.2.4.2 标准曲线的绘制。精密量取“1.2.1”项下4个对照品溶液，按“1.2.3”色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标、不同体积对照品的质量为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归。

1.2.4.3 精密度试验。取编号为S5的雷公藤供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件，连续进样6次，测定并记录各成分峰面积。

1.2.4.4 重复性试验。取编号为S5的雷公藤平行制备6份供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件进行测定，并记录峰面积。

1.2.4.5 稳定性试验。取编号为S5的雷公藤供试品溶液，室温下分别于0、2、4、8、12、24 h按“1.2.3”色谱条件进行测定，并记录各成分峰面积。

1.2.4.6 加样回收率试验。取编号为S5的雷公藤15 g，按“1.2.2”方法处理，所得溶液中分别加入对照品溶液各1 mL，按“1.2.3”色谱条件进行测定，并记录各成分峰面积。

1.2.5 样品含量测定。分别取不同产地的雷公藤药材/饮片S1 ～ S15，每个样品平行取3份，按“1.2.2”方法制备各供试品溶液，按“1.2.3”色谱条件进行测定，记录各成分峰面积，分别计算样品中4种有效成分的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适应性试验。图1表明，在“1.2.3”条件下，样品谱图中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素、雷公藤酯甲的保留时间分别为17、28、65、67 min左右，并且重复性相对较好。

2.1.2 标准曲线的绘制。按照“1.2.4.2”方法操作，以峰面积为纵坐标、不同体积对照品的质量为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，结果见表2。由表2可知，雷公藤中4种有效成分的标准曲线线性关系良好，R2≥0.999。

2.1.3 精密度试验。按照“1.2.4.3”方法操作，计算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素、雷公藤酯甲4种有效成分含量的RSD分别为0.941%、2.006%、3.559%、2.671%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验。按照“1.2.4.4”方法操作，计算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素、雷公藤酯甲4种有效成分含量的RSD分别为1.076%、1.921%、3.665%、2.501%，表明该方法的重复性良好。

2.1.5 稳定性试验。按照“1.2.4.5”方法操作，计算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素、雷公藤酯甲4种有效成分含量的RSD分别为1.927%、2.159%、4.626%、3.132%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.1.6 加样回收率试验。按照“1.2.4.6”方法操作，计算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤红素、雷公藤酯甲4种有效成分含量的平均加样回收率分别为86.72%、107.51%、76.94%、84.38%。

2.2 样品含量测定 按照“1.2.5”方法操作，由表3可知，相比雷公藤饮片（S1～S9），雷公藤药材中4种有效成分的含量普遍较高，尤其以湖南产地（S13、S14）的更为明显。

3 讨论与结论

3.1 流动相的选择 试验中分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%冰乙酸溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2%三乙胺溶液作为流动相进行梯度洗脱，结果表明，相同条件下，流动相为甲醇-水时，4种有效成分的出峰时间相对较慢;流动相为甲醇-0.1% 冰乙酸溶液时，基线上浮，不平稳;流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2% 三乙胺溶液時比用乙腈-0.1%磷酸溶液时的色谱峰分离效果更好，分离度和峰形更好。因此该试验以乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2%三乙胺溶液作为流动相。

3.2 检测波长的选择 试验中选取210、218、225、242、276 nm 5个检测波长，结果表明，在276和242 nm时，4种有效成分的色谱峰吸收较弱;在210和225 nm时，4种有效成分的吸收都比较强，且在225 nm条件下的基线相对平稳且峰形较好，由于雷公藤红素和雷公藤酯甲在210 nm时的吸收最强，因此试验中检测波长选择为0 ～ 65 min 225 nm，65 min之后210 nm。

3.3 其他条件的优化 该试验中还对流速及柱温2种条件进行了优化，结果表明，当流速为0.75 mL/min、温度为25 ℃时，色谱峰分离度及峰形较好，故试验中选择了该流速和柱温条件。

3.4 结论 该研究采用HPLC法同时对雷公藤药材中4种有效成分含量进行测定，方法精密度、重复性良好，可同时测定雷公藤药材中4种有效成分的含量，可为该药材的质量控制提供新的科学依据。

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