Dach1表达下调促进结肠癌细胞SW480侵袭和迁移的机制研究*

王金泗，蔡少鑫，曾 伟，程雪飞，刘立航，林孟波

福建医科大学省立临床医学院，福建省立医院肿瘤外科，福州 350001

Dachshund家族转录因子1(Dach1)是RDGN网络通路上的重要抑癌基因，已有报道称Dach1在结直肠癌中低表达，其机制可能与其启动子甲基化有关，但Dach1对结直肠癌侵袭转移功能的影响尚未见报道。低表达Dach1可以通过影响TGF-β通路而抑制多种实体瘤如乳腺癌、前列腺癌的侵袭转移，因此存在潜在的影响结直肠癌侵袭转移的功能。本研究通过下调结肠癌细胞系SW480的Dach1表达后，进一步研究其对SW480细胞迁移、侵袭的作用变化，并研究其可能的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 主要细胞、试剂和培养液

SW480细胞购自ATCC；DMEM培养液及新生小牛血清购自Hyclone公司；转染用无血清Opti-MEMI购自Sigma公司；荧光素酶实验试剂盒购买于Promega公司；Zeb1、GAPDH的荧光定量PCR引物由上海英骏生物有限公司合成；miR-200b，miR-200c，U6引物，miR-200c mimics及对照，si-Dach1，RNA逆转录试剂盒及转染试剂盒购买于锐博公司。序列为：si-Dach1正义链：5′-GCCUCCUAAGAGGACUCAATT-3′，反义链：5′-UUGAGUCCUCUUAGGAGGCTT-3′)；RNAi阴性对照正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)；GAPDH正义链：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反义链：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；Zeb1正义链：5′-GAACAGGACTCAAGACATCTCAGTGT-3′，反义链：5′-GGTTTATTCTCTATCTTTTGCCGTATCT-3′。单克隆抗体Dach1、E-cadherin、β-catenin、Zeb1购自Santa Cruz公司，GAPDH抗体以及HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗及羊抗鼠荧光二抗购于武汉博士德公司。

1.2 细胞培养和转染

细胞培养于含10%新生小牛血清的DMEM培养液中。转染前6孔板中每孔接种约5×105个细胞，培养24 h后进行转染，按照转染试剂盒使用说明，实验分组为：对照组(SW480con组，转染siRNA对照序列)，低表达Dach1组(SW480si-Dach1组，转染si-Dach1)，低表达Dach1同时高表达miR-200c组(SW480si-Dach1+miR-200c组，转染si-Dach1+miR-200c mimics)。

1.3 Real-time PCR检测miR-200b、miR-200c水平

使用Trizol提取各细胞中的RNA(步骤按照产品说明书)，运用逆转录试剂盒使RNA逆转录为cDNA。……