利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点

张月乔 葛洁 田树娟 袁黎

摘 要： 西瓜遗传转化技术周期长，过程复杂，CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应，为了保障所选择的靶位点的可行性，本研究选择西瓜ClSPO11-1基因（ID：Cla003301）为靶标，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体，利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体，通过简单的组培过程，使西瓜外植体长出不定根，在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失，经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变，成功实现了对西瓜不定根的基因编辑，该方法周期短，操作简便，实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率，为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。

关键词： 西瓜; CRISPR/Cas9系统; 发根农杆菌; 基因敲除

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2020）04-007-05

Abstract： Watermelon genetic transformation technology is time consuming and process complicated. The CRISPR/Cas9 gene editing system has a certain off-target effect. In order to ensure the feasibility of the selected target site， the watermelon ClSPO11-1 gene （ID：Cla003301） was selected in this study as target， using the CRISPR/Cas9 gene editing system to construct a double-target gene knockout vector， using Agrobacterium rhizogenes Ar. Qual strain to infect watermelon cotyledon explants， and to make watermelon explants growing through a simple tissue culture adventitious roots. In the adventitious roots， different degrees of base deletions at target site 1 were detected. After comparison and analysis with amino acid sequences of wild-type ， both premature translation termination and amino acid mutations was found. This method has a short cycle and simple operation. It achieves the rapid target identification efficiency of selected target sites in watermelon， and provides a guarantee for the study of watermelon gene function and genetic improvement.

Key words： Watermelon; CRISPR/Cas9 system; Agrobacterium rhizogenes; Gene knockout

西瓜（Citrullus lanatus）属于葫芦科西瓜属，是原产于非洲的一种重要经济作物，因其具有清热解暑，除烦止渴，通便利尿和降血压等多种功效，深受人们喜爱，并广泛栽培于世界各地。目前，我国西瓜的栽培面积、产量及人均消费量均居世界首位[1]，北起黑龙江，南到海南岛，西从西北边疆，东到东南沿海，均有栽培。随着西瓜全基因组测序的完成，西瓜的遗传研究已经步入了后基因组的时代[2]，对于西瓜重要的一些农艺性状相关的基因虽有预测，但对于其功能的验证仍然存在着一定的困难。

基因编辑技术作为合成生物学的核心技术，是近几年发展起来的对基因组进行定向精确修饰的技术，在特定的基因位点产生DNA双链断裂，借助编辑受体DNA自身的修复系统可以对基因组中的靶位点进行敲除、插入、碱基替换、点突变等定点人工修飾。……