蛋体水解液的益生菌发酵酶解工艺及产品制备研究

孙 郡

生物工程

蛋体水解液的益生菌发酵酶解工艺及产品制备研究

孙 郡

（武汉轻工大学，湖北 武汉 430040）

在传统加工方法基础上，将米醋替换为乳酸，再进行水解工艺的优化，最优方案所得蛋液水解度最大可以达到24.184%，在此基础上再使用蛋白酶进行酶解与多种益生菌进行发酵，所得样品肽含量最高可达到1.526 mg/mL，相比传统醋蛋液与发酵蛋液优势明显。经测定经过多重水解的蛋液游离氨基酸种类齐全，钙、铁、锌等无机元素含量较高，且具有良好的抗氧化能力。再将得到的蛋体水解发酵液喷雾制粉，调味复配，即可得到一种具有钙含量高、低胆固醇、富含小分子肽且风味良好的功能食品。

蛋；乳酸水解；蛋白酶解；益生菌；功能食品

醋蛋是一种传统民间食品，其中的化学原理是蛋壳上的钙与米醋中的醋酸发生反应生成醋酸钙，以此来达到对蛋壳充分利用的目的[1]。

以乳酸对鸡蛋进行水解，加工中无酸味刺激，达到水解目的，生成乳酸钙，乳酸钙是一种营养强化剂[2]。且乳酸钙的吸收率也远远大于醋酸钙，产品风味也得到改善。

鸡蛋在乳酸水解过程中，鸡蛋中的蛋白质被水解成低分子蛋白、肽类、氨基酸。肽链的断裂生成分子量不等的多肽，部分疏水性氨基酸水解后裸露在外，和舌头上的苦味受体相接触从而感受到苦味[3]。使用复合风味蛋白酶对酸水解蛋液进行进一步水解，同时借鉴鸡蛋乳酸菌发酵饮料[4]工艺，进行发酵处理，旨在改善口感单一及蛋液的风味，后增添益生菌并富集微量元素，提升营养价值与保健功效[5]。

1 材料与方法

1.1 主要设备及材料

LRH-70型恒温培养箱、pH240A型干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；T118digital型超高速分散器：德国IKA；HH-2型电热恒温水浴锅：国华电器有限公司；Sorvall RC6 Plus型冷冻高速离心机：赛默飞世尔有限公司；Evolution220型紫外分光光度计：美国Thermo Fisher公司；GI54DS型超高温灭菌锅：美国Zealway公司；DL-CJ-1NDⅡ型无菌操作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；Yc-2000型喷雾干燥机：上海雅程仪器设备。

优质绿色鸡蛋：武汉锐福志科技有限公司；风味蛋白酶（1×105U/g）：河北格贝达生物科技有限公司；优质L-乳酸（食品级99%）：江苏瑞多生物工程有限公司；碳酸氢钾（食品级）：江苏科伦多食品配料有限公司；葡萄糖（食品级）、麦芽糖（食品级）、麦芽糊精（食品级）：万利达生物科技有限公司；

牛血清蛋白，DPPH等：皆为分析纯（AR），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸水解蛋液的制备工艺

将选取的优质鸡蛋表面进行擦拭、清洗、消毒后，密封罐内加入乳酸，将鸡蛋放入浸泡36~ 48 h，观察蛋壳是否被完全软化溶解，再将蛋膜挑破，静置24 h后将溶液搅拌均匀，纱布过滤掉不溶的蛋膜与少量杂质，再用高速分散机进行分散均质，即可得到酸水解蛋液[1]。

1.2.2 乳酸水解蛋液浸泡工艺单因素实验与响应面分析

以一个鸡蛋为单位进行泡制，外部温度设置：15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃。时间设置：24 h、48 h、60 h、72 h、96 h。乳酸用量分为：50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL。开展单因素实验以测定蛋液中蛋白质水解度，初步选取合适的单因素条件。

为进一步确定酸水解蛋液制作的最优工艺，实验设三个因素分别为浸泡时间、浸泡温度、乳酸用量，实验水平根据单因素实验的结果拟定。利用三因素三水平响应面分析实验方法，确定乳酸水解蛋液的最优工艺参数[1]，实验因素的水平编码见表1。

表1 因素水平表

1.2.3 蛋体水解液的酶解及混菌发酵正交实验

由于风味蛋白酶可产生独特的风味，有效减少水解造成的苦味，故选取风味蛋白酶对酸水解蛋液进行双重水解。

酶解前处理[1]：选取最佳制作工艺下的乳酸水解蛋液进行均质过滤，得到均匀的蛋液。用食品级的碳酸氢钾配置成20%的溶液调节蛋液pH到6.5左右，在调节pH的过程中，滴定应少量多次，确保准确性。

酶解：参考了风味蛋白酶水解蛋清的工艺条件[9]，向调节好pH的蛋液加入风味蛋白酶，53 ℃进行酶解，酶解时间为5 h，对酶解程度影响较大的因素，酶的添加量将作为一个单因素进行后续实验。

混菌发酵[1]：对蛋液进行混菌发酵，三种菌分别为保加利亚乳杆菌、酵母菌和嗜热链球菌，按配方分别配制各培养基[10]，并制备发酵菌种。

取水解液置于灭菌过锥形瓶中加入4%葡萄糖作为稳定碳源，搅拌均质后进行低温杀菌，完成后置于无菌操作台中冷却接种，保加利亚乳杆菌，酵母菌，嗜热链球菌比例为1∶1∶0.4，接种量为0.6%。发酵过程中先置于37 ℃的恒温培养箱进行培养，一段时间后降温至30 ℃在进行二段发酵。

对二段发酵的时间进行拟水平正交实验，并对其中的肽含量进行测定。正交实验因素水平如下表2。

表2 因素水平表

1.2.4 发酵全蛋体水解液的制粉复配实验

制作传统醋酸水解蛋液，步骤与1.2.1中乳酸水解蛋步骤相同，将乳酸替换为米醋，测定其肽的含量。制作普通发酵鸡蛋乳，发酵条件与文中最优条件一致，测定肽的含量。将两者与文中研究的蛋体水解液的肽含量作对比。

风味和色泽是作为一个面向大众的功能食品必不可少的要求，而发酵全蛋体水解液在喷雾干燥的过程中，容易黏壁，造成得粉率较低的问题，故在喷雾干燥之前加入一定比例的麦芽糊精作为助干剂，能在保持产品原有风味的同时减少黏壁现象的产生，使粉末更蓬松不结块，溶解性更好[11]。喷雾干燥后得到蛋粉，向其加入一定量的奶粉和麦芽糖进行风味调配，改善蛋粉的口感及香气，复配辅料的添加量见表3，并对复配后冲调的气味及口感进行评比[1]。

表3 辅料添加量 %

1.3 测定方法

粗脂肪含量测量：采用索氏抽提法，国标GB T 14772—2008。

蛋白质含量测量：国标GB 5009.5—2016。

水解度（DH）[7]的测量：国标GB 5009.235—2016。

肽含量的测定[8]：制备标准牛血清蛋白溶液、双缩脲试剂、10%的三氯乙酸溶液，并对样品进行前处理，在540 nm波长下制作标准曲线，进行样品测定后代入标准曲线计算样品的肽含量。

同时测定样品的pH、DPPH自由基清除能力、氨基酸组成及微量元素。

2 结果与讨论

2.1 乳酸水解蛋液的制备工艺研究

2.1.1 单因素实验结果

根据上文单因素变量所得结果以确定最佳条件，结果见图1~3。

图1 时间对水解度的影响

图2 温度对水解度的影响

图3 乳酸用量对水解度的影响

从图1中可以明显的看出随着浸泡时间的增加，水解度呈一个先上升后下降的趋势，当浸泡时间60 h和24 h相比有一个明显的上升，水解度由19.39%上升到21.67%达到最大，而在实际操作过程中发现，浸泡时间会影响蛋液的品质，时间过久会使蛋黄硬化。因此根据多种因素选择浸泡时间为60 h。从图2中可以看出温度与水解度的关系，在温度为25 ℃的时候，水解度达到了最大21.98%，而当温度继续上升到30 ℃的时候，水解度却开始下降。图3为单个鸡蛋乳酸用量的结果，在乳酸用量为150 mL时，水解度达到最大22.47%，在实际制作过程中发现，乳酸的用量会影响蛋壳溶解效果和蛋液的风味，出现未溶解完全或口感过酸的现象，综上认为乳酸150 mL时为最佳。

2.1.2 响应面分析实验结果

自变量分别为：乳酸用量、浸泡时间、浸泡温度，响应值为蛋白质水解度，做响应面分析实验。实验设计及结果见表4。

表4 响应面分析方案及实验结果

回归方程为：

=23.23+0.53+1.84+0.22+0.63+1.11– 0.14–1.892–2.332–0.0492

根据各水解实验结果与检测数据，利用统计软件对数据进行处理，可以得到二次回归方程的相应曲面以及其等高线见图4、图5、图6。

分析上图可知，各因素对水解度的影响大小为：>>。对表4中的数据进行分析，乳酸蛋液泡制的最优方案为在外部温度为25 ℃，一个鸡蛋加入175.23 mL的乳酸，浸泡65.19 h时，水解度最大可以达到24.184%。但为了实操中准确性及便捷性，把以上条件修正为乳酸用量175 mL，浸泡时间65 h，温度25 ℃，且验证实验结果和预测值差别较小。同时为减少误差，在允许的范围内选取大小均一，同一品种的绿色鸡蛋和优质L-乳酸作为原材料。

图4 浸泡时间和乳酸用量对酸水解蛋液制备水解度的响应面曲线和等高线图

图5 浸泡时间和浸泡温度对酸水解蛋液制备水解度的响应面曲线和等高线图

图6 乳酸用量和浸泡温度对酸水解蛋液制备水解度的响应面曲线和等高线图

2.2 蛋体水解液的酶解及混菌发酵正交实验结果

根据方法制得牛血清蛋白的标准曲线方程为= 0.517+ 0.111 4，2= 0.986。将样品测得的吸光度值代入标准曲线即可。

根据正交实验表列出的实验方案制得的发酵全蛋体水解液，对其进行肽（TAC-SN）含量的测定，并将肽含量记录在表5中。

分析上述数据可知，在风味蛋白酶添加量为0.4%，第一段发酵：温度37 ℃，发酵时间为12 h。第二段发酵：温度30 ℃，发酵时间为8 h，发酵出来的双重水解蛋液的肽含量最高。

表5 正交实验结果

验证实验：按照最优方案所得条件进行验证实验结果表明，肽含量为1.526 mg/mL，故该条件为最佳的酶解发酵条件。但在实际生产产品的过程中，应该综合考虑各类因素，如色泽口感经济效益等，从而确定发酵时间与酶添加量[1]。

2.3 发酵全蛋体水解液的营养成分分析

由表6可以看出，发酵全蛋体水解液pH值较低，较低的pH能够抑制杂菌生长，达到延长保质期的目的。而蛋液中的粗脂肪含量较低，蛋白质和肽含量较高，达到了低脂肪、高蛋白、易吸收的目的。同时该产品具有良好的抗氧化能，对DPPH自由基的清除能力高达96.15%。

表6 发酵全蛋体水解液的营养成分

图7为不同工艺下蛋液中肽的含量测定对比，可以看出相较于发酵蛋液的肽含量1.017 mg/mL和传统醋蛋液的1.204 mg/mL，本文所研究的发酵全蛋体水解液中的含量最高达到1.526 mg/mL。故进行多重酵解工艺可以很好地提高了肽的含量，易于人体的吸收，更好的证明全蛋体的多重酵解思路的必要性[1]。

表7为发酵全蛋体水解液的游离氨基酸组成。从表中可以看出，所测定的游离氨基酸总含量达到217.92 mg/dL，游离氨基酸的种类较为全面，在所测定的氨基酸含量中丙氨酸、赖氨酸和谷氨酸含量最高。作为游离氨基酸中含量最高为28.19 mg/dL的赖氨酸，它能够增强免疫力，提高中枢神经组织和促进人体发育的功能，是人体必需的氨基酸。

图7 不同工艺下蛋液中肽的含量

表7 发酵全蛋体水解液的游离氨基酸组成 mg/dL

表8为发酵全蛋体水解液中无机元素含量。从表中可以看出，钙、锌、磷、镁、铁五种人类不可或缺的元素中，钙的含量高达176.84 mg/dL，由于蛋壳与乳酸的反应，蛋壳中的钙转化为乳酸钙存于溶液中，乳酸钙相比其他钙质更易被人体吸收利用，无论是对青少年骨骼的生长发育，改善老年人的骨质疏松都有较好的疗效，同时还具有调节肠道营养与消化的功能。其次含量较高的是磷元素，而在人体中，人体酸碱平衡的调节的部分功能是由磷元素参与完成的，它通过协助脂肪和淀粉的代谢过程，给机体供量并提高人的精神活力。

表8 发酵全蛋体水解液中的无机元素 mg/dL

2.4 多重酵解全蛋粉的复配工艺及生产流程

在发酵全蛋体水解液中加入麦芽糊精后，在选取性状最优的醋蛋粉进行辅料复配，并进行感官评价后所得结果为：在喷雾干燥前加入10%的麦芽糊精后进行制粉，复配时向蛋粉中加入麦芽糖5%、奶粉3%，冲调得到乳液口感较为协调，风味纯正没有杂味。

综合考虑实际生产的过程中各种因素后设计改进出如下工艺流程[1]：

鲜禽蛋的挑选与清洗：新鲜鸡蛋→初选→光检→45 ℃温水清洗10 min（喷淋、刷洗）→干燥→杀菌（紫外杀菌）

发酵全蛋体水解液加工工艺如下图8。

图8 工艺流程图

2.5 多重酵解全蛋粉成品

从图9可以看出，根据本文制作步骤所得的蛋粉呈金黄色粉末状，无结块或粘黏现象，粉状良好。粉状品尝风味主要为不强烈不刺激的酸味，无蛋液腥味。温水冲调后所得乳液，溶解性较好，色泽为淡黄色偏白，质地均匀的乳浊液，风味口感较好。

图9 多重酵解全蛋粉成品

3 结论

实验分析可得，泡制的时间是对水解度产生影响的最大因素，以65.19 h为宜。乳酸水解蛋液工艺的最优方案为单个鸡蛋乳酸用量175.23 mL，在外部温度为25 ℃下，浸泡65.19 h时，水解度最大可以达到24.184%，具体数据根据实际情况可适当调整简化。

风味蛋白酶对蛋液进行酶水解，酶添加量0.4%，水解温度53 ℃，时间5 h，酶解完成后，向溶液中加入4%的葡萄糖，低温杀菌并灭酶，随后将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、酵母菌三种菌种的接种比例为1∶1∶0.4，接种量为0.6%。接种完成后进行二段式的发酵。第一段温度设定为37 ℃，时间设为12 h，第二段温度设定为30 ℃，时间设为8 h。此条件下制成的样品中肽含量最高，达到1.526 mg/mL。

对所制得蛋液中的各项指标进行检测，发现所制得蛋液中的蛋白质与钙离子含量较高，分别为32.15 mg/mL与176.84 mg/dL。粗脂肪含量较低为23.21 mg/mL，对DPPH自由基的清除能力高达96.15%。游离氨基酸种类齐全，其中赖氨酸含量达到28.91 mg/dL，达到了高钙、脂肪含量低、胆固醇含量低，有良好的抗氧化功能且氨基酸含量高的目的。同时与其他样品对比发现，发酵鸡蛋液肽的含量最低，仅为1.017 mg/mL。传统醋蛋液中的含量1.204 mg/mL，而本实验所提出的发酵全蛋体水解液中肽的含量最高达到1.526 mg/mL，证明本实验的必要性。将所制得的发酵蛋体水解液中添加10%的麦芽糊精进行喷雾干燥制粉，复配的比例为麦芽糖5%、奶粉3%，此时所得蛋粉用温水冲调后，口感风味较好。本文所得到的多重酵解全蛋粉可以作为一种直接饮用的风味较好的功能性食品或配料。

[1] 孙郡. 全蛋体水解液的益生菌发酵工艺优化及产品开发[D].武汉轻工大学, 2019.

[2] 志田正二. 化学词典(日)[M]. 北京科学出版社, 1981.

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备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。

Probiotic fermentation enzymatic hydrolysis processand product preparation of shell eggs hydrolysate

SUN Jun

(Wuhan Polytechnic University, Wuhan, Hubei 430040, China)

Based on traditional processing methods, replacing rice vinegar with lactic acid, and then optimizing the hydrolysis process. The maximum degree of hydrolysis of the egg solution obtained by the optimal solution can reach 24.184%. On this basis, protease is used for enzymatic hydrolysis and various probiotics. When the bacteria were fermented, the maximum peptide content of the obtained sample could reach 1.526 mg/mL, which has obvious advantages over the traditional vinegar egg liquid and fermented egg liquid. It has been determined that the free amino acids in egg liquid after multiple hydrolysis are complete, and the content of inorganic elements such as calcium, iron, and zinc is high, and has good antioxidant capacity. The shell egg hydrolysis fermentation broth is sprayed and powdered, and seasoned and mixed to obtain a functional food with high calcium content, low cholesterol, rich in small molecule peptides, and good flavor.

egg; lactic acid hydrolysis; proteolysis; probiotics; functional food

TS253.4+3

A

1007-7561(2020)03-0122-07

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.019

2020-03-19

孙郡，女，1995年出生，硕士，研究方向为生物活性物质与功能性食品.