细胞外基质与龋病

王家旺

摘 要：生物膜是嵌入在细胞外基质中的微生物群落，具有高度组织结构。龋病是多种因素参与的，生物膜中微生物长时间在菌斑深层产酸，牙体硬组织发生慢性、进行性破坏而形成的。基质的结构和生化特性，增强了生物膜的表面粘附性、空间和化学非均质性、协同/竞争性相互作用以及对抗菌药物的耐受性。本文我们讨论生物膜基质在龋病发病机制中的作用的新进展。

关键词： 生物膜;龋病;细胞外基质

龋病是以细菌微生物为病原体，多种因素参与的，发生在牙体硬组织的慢性、进行性破坏的疾病。通常情况下，致龋性膳食糖紧紧贴附于牙面，使得唾液蛋白形成获得性膜并牢固地附着于牙面 ;在适宜温度下，生物膜中微生物长时间在菌斑深层产酸，侵袭牙齿，使之脱矿，并进而破坏有机质，导致牙齿组织的缺损，乃至整个牙齿缺失。WHO对 186个国家的人群口腔健康进行长达 20 年的纵向调查结果显示，龋病仍影响着 60%-90% 的学龄儿童和大部分成年人，给社会和个人带来较大的经济负担。

目前关于龋病病因学的说法主要有三种[1]，一是认为龋病是由口腔中的某些特异性致龋细菌所引起; 二是认为龋病是由口腔中的一些常驻菌群所导致; 第三种也是目前比较公认的说法，认为龋病是由于口腔微生态环境失衡所致。已经知道，在微生物和宿主之间的共栖和共存中，口腔微生物群保持稳态。然而，在某些情况下，寄生关系发生变化，龋齿微生物的上升导致龋齿。随着先进的分子生物学技术的发展，发现了新的致龋微生物种类，人类口腔微生物群也逐渐被了解。然而，我们通常采取的龋病预防措施不能完全适用于每个人。个体发生蛀牙的机会取决于免疫系统和口腔微生物群等因素。本文中，我们回顾了相关文献，并讨论了微生物生物膜在龋病中的作用。

1口腔生物膜

生物膜被定义为基质包裹的互相粘附，或粘附于牙面、牙间，软而未矿化的微生物群落，其由口腔微生物、宿主和宿主饮食之间动态相互作用，导致口腔表面的微生物定植及牙菌斑的形成[2-3]。随着DNA和RNA测序技术的发展，不同口腔部位生物膜菌群的组成、基因组和行为的多样性逐渐被认识。同时，对于细胞外基质如何控制细胞与细胞间相互作用、创造微环境和改变生物膜毒力方面的认识也逐步深入[4]。

影响口腔表面微生物群组成的因素有很多，尤其是当牙齿萌出时，此时共生和机会性病原体的定植有了新的、非表皮的表面，这些影响因素包括年龄、饮食、口腔卫生、全身情况和免疫状况以及某些药物作用等[5-6]。研究者们已在病人或实验动物身上证明了饮食在微生物定植中所起的关键作用。当宿主过度暴露于食物中的糖分时，牙齿上形成的生物膜的结构和组成将发生显著的变化，定植的微生物群落变得非常适合代谢碳水化合物并产酸，导致龋齿[7]。

2 EPS

早期的研究主要集中在生物膜的微生物组成上，近期的研究发现，生物膜内的微生物嵌入在含有胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）的基质中。基质在微生物集体行为和毒力，以及对抗菌药物的耐受性方面的作用，正日益得到认识，并被认为是生物膜生活方式的组成部分。EPS直接介导微生物对表面的粘附和细胞间的粘附，同时形成聚合物基质，增强生物膜的机械稳定性。此外，EPS基质有扩散修正特性，导致化学/营养梯度的形成。pH、氧化还原和营养利用率的不同，会影响生物膜内微环境及其微生物行为[8]。因此，在基质中，细胞组织成多细胞生态系统，彼此发生协同和拮抗作用，有助于创造具有不同致病潜能的局部微生态。

随着微生物组学和基质生物学的发展，逐渐认识到多微生物相互作用和局部生物膜微环境的变化，对龋病的发生发展起重要作用。相反，数十年的研究清楚地表明，病原体已经发展出一系列机制来增强生物膜[9]。口腔内环境的变化，例如糖的消耗增加或免疫反应的改变，均可以触发病原体重塑局部微环境和微生物群落。然而，关于病原体如何改变微生物群落和群落行为，重塑局部微环境的，却鲜为人知。此外，共生菌和病原体是如何共存的，并且在生物膜基质中相互竞争以影响疾病过程仍然不清楚。

基质的结构和生化特性提供了生物膜的新特性，包括表面粘附性、空间和化学非均质性、协同/竞争性相互作用以及对抗菌药物的耐受性增强。EPS基质的形成取决于基质有效性、胞外物质的合成和分泌、剪切等应力。与龋齿相关的口腔生物膜的主要基质成分是多糖，特别是变形链球菌衍生葡聚糖。此外，其他物种（如放线菌、唾液链球菌和红链球菌）和杂交种也可产生可溶性葡聚糖和果聚糖淀粉葡聚糖。与其他基质一样，致龋生物膜也含有eDNA[10]，具有淀粉样特性的细菌衍生蛋白质，以及宿主蛋白质和糖蛋白，它们与葡聚糖结合形成基质支架。然而，这些外聚物在基质中的功能和结构仍不清楚，它们在生物膜的微生物组成和致龋潜力中的作用需要进一步研究来阐明。葡聚糖是由链球菌葡萄糖基转移酶（glucosyltransferases，Gtfs）协同作用产生的[11]。细胞外释放的Gtf酶可以活性形式结合于牙齿表面，就地产生葡聚糖，提供新的细菌结合位点。此外，分泌的Gtf还与其他口腔微生物（共生链球菌，放线菌、乳酸杆菌，甚至白色念珠菌）结合，使其产生葡聚糖。研究者在Gtfs合成葡聚糖的过程中，使用荧光探针直接掺入时发现，EPS基质时空顺序及其与生物膜中细菌的空间排列被显现出来。这些细胞外聚合物在细胞膜上的不同位置聚集，各种聚合物相互补充，形成新生的EPS基质，并协调生物膜的发育，包括表面粘附、细胞-细胞粘附和形成类似于其他生物膜系統中发现的微菌落的细胞团。随着生物膜的成熟，EPS的持续原位生成，使基质三维扩展，包围细胞团，并在3D基质支架内形成一个高度分隔但有凝聚力的结构。EPS合成形成的这种空间组织，及其合成的不均匀性，恰恰可以解释在人类口腔生物膜中发现的不同大小和组成的微生物群落[12]。

EPS也会影响生物膜的力学性能，例如增加对表面的粘合强度和粘结性。随着生物膜的成熟，基质硬度会增加。在后期，成熟的生物膜可以释放出小的聚集体，甚至单个细胞，通过基质降解，在其他部位重新启动生物膜的生命周期[13]。生物膜基质的物理化学性质还可以通过减少药物的获取和触发抗菌药物的耐受性来保护嵌入的细菌。例如，EPS可以结合阳离子抗菌药物，如氯己定，防止渗透到生物膜的深层，从而降低灭菌效能。

大多數生物膜内化学和营养“梯度”的形成，依赖于基质物理屏障作用和局部微生物代谢之间的平衡。在此过程中创造出许多不同浓度的pH、O2、无机离子、信号分子、代谢物和其他溶质的生物位点。因此，微生物的定位和它们的应激反应机制可能与它们对低pH或低氧环境的敏感性和特定配体、营养素或生物分子的存在有关。这种异质环境可以局部调节基因表达，影响不同物种之间或分布在生物膜结构内的不同细胞群之间的代谢和细胞间信号传导，协调它们共同的“社会行为”、空间组织和/或生理异质性。最近的研究表明，细菌聚集体可以诱导生物膜内细胞亚群的转录组变化。

牙齿表面的唾液能够缓冲中和口腔中的酸，而EPS基质限制了带电离子在缓冲液中的扩散，而不带电的溶质，如蔗糖，可以扩散到生物膜中并且可以很容易地被嵌入的细菌代谢成酸。此外，胞外葡聚糖似乎可以直接捕获质子，帮助在生物膜中保留和积累酸。生物膜基质还可以通过固定外源酶，使它们能够在接近细胞的同时代谢底物，参与基质重塑。pH在口腔生物膜结构中的不均匀空间分布一直备受重视。直接固定在生物膜基质中的荧光pH探针显示，尽管暴露在中性条件下，完整生物膜内的仍显示出三维pH分布，并且在这些特定区域积聚和限制的酸不易中和。因此，EPS可以通过帮助生物膜粘附、空间定位代谢物，调节牙齿界面的持续酸化，并可能限制唾液的缓冲，有助于创建龋齿微环境。

总之，EPS增强了细菌间的粘附-结合和种间的结合，同时通过基质的形成，将细胞嵌入到不同的微生物群组中。EPS基质作为一个扩散控制屏障，通过调节溶质进入生物膜内部并将产生的酸捕获在生物膜内，除了产生氧梯度外，还是内源酸的产出场所。内嵌的微生物必须处理各种应力（酸性、低氧）和不断波动的营养成分，以维持口腔生物膜，这是龋病发病的先决条件。产生EPS的病原体可以被认为是“生物膜环境调节器”，有助于在复杂的微生物群落中建立病理微生态。

目前对于龋病发生发展过程中，细胞外基质分子和功能变化，及其与多微生物相互作用的时空变化仍有待进一步研究。此外，目前对于EPS基质如何提供结构支架，如何控制微生物的聚集、定位和活动的，并不十分清楚。基质介导的变化可以改变细胞间的相互作用，特别是不同微生物物种之间的相互作用。深入分析生物膜基质、局部微生物组分和宿主之间的结构和功能相互作用，将促进我们对口腔和其他多微生物疾病致病机制的了解，以提供精准的靶向治疗及预防措施。

参考文献：

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