国产小麦品种麸皮结构层的定性和定量分析方法

陈中伟 夏 清 黄清清 孙 俊 徐 斌 姜 松

(江苏大学食品与生物工程学院1，镇江 212013)

(江苏大学农产品加工工程研究院2，镇江 212013)

我国是小麦生产和消费大国，小麦的年产量和年消费量约达1.26亿t和1.2亿t[1, 2]。然而，国内全麦粉及全麦食品加工业发展缓慢。目前，回填法加工全麦粉由于能耗低、与现有装备衔接性好，是国内加工全麦粉的主流方法。麦麸是小麦粉加工的主要副产物，富含膳食纤维、酚类、B族维生素和矿物质等，具有促进平衡膳食、益生肠道、调脂降糖等功能[3-5]，是回填法加工全麦粉的主要原料之一。然而，由于缺乏相应的产品标准和量化测定手段，麦麸添加量无法准确测定，市场上的全麦粉质量层次不齐，难以得到消费者认可。

目前，已有关于麦麸结构层的标示成分的研究。法国农科院团队对欧美小麦的麦麸结构层标示成分的研究结果表明，阿魏酸脱氢三聚体、烷基间苯二酚(ARs)、p-香豆酸、植酸分别富集在外果皮、中间层、糊粉层细胞壁和细胞内容物中，可定量标示外果皮、中间层、糊粉细胞壁、糊粉细胞质的含量[6-8]。然而，小麦的生化组成及含量受品种和种植地域的影响很大[9-11]。因此，国内小麦产品的判定不能套用国外品种的数据，需要建立以国产小麦品种为基础的测定数据。然而，目前针对国内小麦品种麸皮结构层标示物的研究缺乏，难以为国内全麦粉及全麦食品的真伪判定提供支撑。

本研究选取具有代表性的6种国产小麦品种(2种红麦和4种白麦)，手工剥离获取麦麸结构层，然后通过微观染色、显微观察，获取小麦结构层的微观结构特征；并利用HPLC、显色法等方法分别定量测定麦麸结构层中的酚酸、酚脂和磷等生化成分的含量，得出各结构层中相关标示物的组成及含量，并对其准确性进行定量验证，以期为全麦粉及全麦食品的定性和定量判定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红麦(云麦42、云麦59)、白麦(郑麦9023、济麦22、川麦107、烟农21)：购于小麦种站；麦麸；p-香豆酸(色谱纯)、3,4,5-三甲氧基肉桂酸(色谱纯)、橄榄醇(色谱纯)；阿魏酸(98%)、乙酸乙酯(分析纯)；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

UV1800紫外分光光度计；SBA-40C葡萄糖分析仪；Aglient1260高效液相色谱仪、色谱柱：Eclipse Plus Phenyl-Hexyl column(5 μm, 250 mm×4.6 mm)、ZORBAX C18 column (5 μm，250 mm×4.6 mm)、 CX-31显微镜和CX-51荧光显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 小麦麸皮结构层的手工剥离制备

取小麦籽粒10 g，在4 ℃条件下用水浸泡24 h。利用镊子从麦芒一端剥离外果皮，同时去除胚芽。然后，将剥离外果皮后的小麦籽粒继续浸泡至松软，将小麦籽粒纵向切成两半，刮尽胚乳，得到中间层和糊粉层。最后，将糊粉层轻轻刮下，剩余的结构层为中间层。将样品干燥至12%含水量后，称量获得麦麸各结构层的质量比例[12]。

1.3.2 麦麸结构层的显微结构观测方法

表面显微结构观测：将麦麸各结构层样品置于盖玻片上，滴加去离子水后加盖玻片，置于显微镜下观测，选取具有代表性的图片。截面显微结构观测：切片的制备、染色过程及观测方法参考文献[13, 14]。截面结构切片的制备：取15 mL去离子水于25 mL烧杯中，加入1 g琼脂后置于沸水浴中溶解。添加0.5 g麦麸结构层粉末，搅拌均匀，利用超声脱气(脱气期间温度不低于45 ℃)。脱气后迅速将烧杯置于-18 ℃，待琼脂凝固后切成1 cm小块。将琼脂块置于1%戊二醛溶液中12 h，然后利用冷冻切片机切出厚度为8 μm薄片，置于载玻片上，晾干后，分别用1%酸性品红-乙醇溶液和0.01%荧光增白剂-水溶液染色2 min，洗去多余染色液，晾干封片。利用荧光显微镜(400～410 nm)进行观测，选取代表性的样品图片。

1.3.3 酚酸含量测定

称取麦麸各结构层(过150目筛)20 mg，加入10 mL的2.0 mol/L的NaOH溶液，充氮后置于恒温摇床中，在35 ℃，120 r/min的黑暗条件下水解2 h。然后，加入50 μL的1 mg/mL的3,4,5-三甲氧基肉桂酸的50%甲醇水溶液作为内标物，并用6 moL/L盐酸中和至pH=2。用20 mL乙酸乙酯分萃取两次，合并萃取液并浓缩至2 mL。利用氮气吹干后，加入0.8 mL的50%甲醇复溶。最后，用0.45 μm有机相微滤膜过滤后，用于HPLC测定，并根据文献方法计算含量[15]。酚酸的高效液相色谱测定方法：检测器：紫外检测器；波长：325 nm；进样量：20 μL；流动相：A：1 mmol/L三氟乙酸水溶液；B：乙腈/1 mmol/L三氟乙酸水溶液(90∶10，V/V)；流速：1 mL/min；柱温：45 ℃；流动相梯度：0～15 min：85% A；15～20 min：82% A；20～25 min：80% A；25～55 min：72% A；55～58 min：55% A；58～60 min：85% A。

1.3.4 烷基间苯二酚含量测定

称量0.2 g待测样品，加入50 μL的1 mg/mL橄榄醇-甲醇溶液作为内标物，加入20 mL乙酸乙酯，在25 ℃避光条件下振荡提取24 h。然后，在4 000×g条件下离心15 min，取4 mL上清液用氮气吹干后复溶于1 mL甲醇中。最后，用0.45 μm有机相微滤膜过滤，密封后供HPLC分析，液相测定条件：Angilent 1260；ZORBAX C18 column色谱柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；荧光检测器，激发波长276 nm；发射波长306 nm；流速：1 mL/min；柱温：59 ℃；流动相A：甲醇/水(89∶11，V/V)；流动相B：甲醇/水(99∶1，V/V)；流动相梯度：0 min，A∶B (100∶0)；6 min，A∶B (75∶25)；18 min，A∶B (0∶100)；20 min，A∶B (100∶0)；22 min，A∶B (100∶0)[16]。

1.3.5 总磷含量测定

参照GB/T 6437—2002测定总磷含量。

1.3.6 数据统计

2 结果与讨论

2.1 国产小麦品种麸皮结构层的比例及显微结构

2.1.1 国产小麦品种中麸皮结构层的比例

图1为手工剥离所得小麦麸皮结构层。中间层的色泽最深，呈棕黄色；糊粉层的色泽最浅，呈乳白色。由于糊粉层是胚乳最外层，其色泽接近于胚乳细胞；外果皮呈浅黄色，具有半透明性。

图1 手工剥离所获小麦麸皮结构层(云麦59)

表1列出了6种国产小麦的麦麸结构层相对比例。麸皮所占麦粒的比例约为18%，其中白麦总体略高于红麦；麦麸中外果皮所占比例最小，其次为中间层，糊粉层所占比例最大，约占50%。红麦外果皮比例略高于白麦，而糊粉层在白麦中所占比例略高于红麦。6种小麦中，糊粉层和中间层所占比例的品种间极差较小(<10%)，外果皮的极差较大(20%)，同时国内小麦品种与国外品种也有一定差异[17]。

表1 6种中国小麦中麦麸及其结构层的相对比例

注：同列中相同字母代表在P<0.05水平无显著差异，不同字母代表有显著性差异。

2.1.2 小麦麸皮结构层的表面显微结构

图2为小麦麸皮结构层的显微结构，分别选取了具有代表性的白麦(济麦22)和红麦(云麦59)。如图2所示，外果皮由狭长的纤维状细胞交替构成，细胞大小约为80 μm×40 μm(图2a1)。中间层由内果皮、种皮和透明层组成(图2b1)。红麦的中间层(图2b2)色泽较深，种皮中呈现棕色斑点，白麦的中间层中未呈现色素斑点。糊粉层(图2c1和图2c2)由大小约为50 μm的不规则的细胞组成，与外果皮的纤维状细胞不同，糊粉层细胞厚大，透光率低。小麦麸皮结构层的显微结构具有明显不同，可以通过显微观测轻易分辨。

注：a1、b1和c1为白麦(济麦22)的外果皮、中间层(Tc：种皮；Nu：珠心层；Cc：横状细胞)及糊粉层；a2、b2和c2为红麦(云麦59)的外果皮、中间层及糊粉层；图中标尺为200 μm。图2 小麦麸皮结构层的表面显微结构

2.1.3 小麦麸皮结构层的截面显微结构

图3为剥离前后小麦麸皮的横截面显微结构。经酸性品红和荧光增白剂染色后，麦麸糊粉层为粉红色(图3a)，主要是由于麦麸糊粉层中的蛋白质与酸性品红结合造成。图3b为荧光下麦麸结构层的微观结构。在紫外光激发下，糊粉层的细胞壁呈亮蓝色，其内容物则呈暗红色；而外果皮和中间层由于自发荧光呈黄绿色。图3c～图3e为剥离后麦麸结构层的荧光显微结构。图3c和3d为外果皮和中间层的截面显微结构，均呈现黄绿色，分别为长、短两类纤维细胞结构。由图3e可知，糊粉层为单层厚细胞，经荧光增白剂染色后，细胞壁呈亮蓝色，细胞内容物呈暗红色。

经酸性品种和荧光增白剂染色后，外果皮和中间层因自发荧光呈现黄绿色，糊粉层细胞壁和内容物则呈亮蓝色和暗红色。通过观察荧光激发条件下的麦麸截面显微结构，可以确定麦麸结构层的剥离和富集情况。

注：a和b分别为光学和荧光显微镜下的麸皮结构；c～e为剥离后的外果皮、中间层和糊粉层。图3 麦麸截面显微结构

2.2 国产小麦品种麸皮结构层的标示物成分

通过显微观测可以确定麦麸结构层的分离和富集情况，但要定量麦麸结构层的添加比例，还需要采用标示物法，即通过分析麦麸结构层中的特有成分或含量差异悬殊的组分含量，然后计算结构层在样品中添加比例。研究表明，外果皮、中间层和糊粉层分别富含阿魏酸脱氢三聚体、烷基间苯二酚(ARs)和植酸[6-8]。因此，此部分对中国小麦麸皮结构层中此类成分的含量进行分析。

2.2.1 国产小麦品种麸皮结构层中酚酸含量

如表2所示，外果皮、中间层和糊粉层中均含对位香豆酸和阿魏酸。其中，中间层的对位香豆酸含量最低，外果皮的平均含量最高，其次为糊粉层，这与文献[6-8]结果有较大差异。在6种国产小麦的麸皮结构层中，糊粉层中阿魏酸的含量均最高，中间层次之，约为外果皮中含量的2～3倍。已有结果表明，透明层的阿魏酸含量较高[17]。由于中间层包含透明层，因此，中间层中阿魏酸含量也较高。然而，阿魏酸只能粗略定性糊粉层和外果皮的富集程度，不足以作为麦麸结构层的定量标示物。

表3中为不同麦麸结构层中阿魏酸二、三聚体的含量。由表3可知，外果皮中阿魏酸脱氢二聚体(DFA)的含量最高，分别是糊粉层和中间层中含量的3倍和4倍。6种小麦中，外果皮中DFA的含量随品种变化的极差较大，而中间层和糊粉层中DFA的含量极差较小。有学者研究表明，阿魏酸脱氢三聚体主要分布在外果皮中[6, 7]，其中5-5’,8-O-4’阿魏酸脱氢三聚体(TriFA)可以作为外果皮的标示物。而在本研究中，外果皮中5-5’,8-O-4’TriFA的含量很低，8-8’,8-O-4’TriFA的含量最高，分别是糊粉层和中间层含量的4.3倍和3.5倍。因此， 8-8’,8-O-4’TriFA可以作为大致定量外果皮的标示物，但由于其在麦麸结构层中差异性相对较小，不足以作为精确定量标示物。

表2 不同小麦品种麸皮结构层中主要酚酸单体的含量

表3 不同小麦品种的麸皮结构层中阿魏酸脱氢聚体含量/mg/g

2.2.2 国产小麦品种麸皮结构层中的烷基间苯二酚含量

麦麸中烷基间苯二酚主要由C17∶0、C19∶1、C19∶0、C21∶1、C21∶0、C23∶0、C23∶1和C25∶0八种同系物组成，其中C19∶0，C21∶0和C23∶0含量较高，见图4。在麦麸结构层中，中间层所含ARs最高，分别约为外果皮和糊粉层中含量的110倍和230倍，与国外小麦品种相似[18]，且ARs的含量在6种小麦品种间的极差较小，见表4。因此，ARs可作为定量中间层含量的标示物。根据测定结果，中间层占小麦麸皮比重为30%，麦麸占小麦籽粒18%。根据AACC标准，国产全麦粉或全麦食品中(全麦粉>50%)，ARs的含量应大于0.32 mg/g。国内研究调查表明，国产全麦粉中AR含量只有0.12 mg/g[19]，远小于全麦粉标准。

图4 小麦麸皮结构层中烷基间苯二酚类化合物的液相色谱图(以中间层为例)

表4不同小麦品种的麸皮结构层中烷基间苯二酚含量/mg/g

小麦品种外果皮中间层糊粉层济麦22(白麦)0.086±0.0079.562±1.0800.037±0.002烟农21(白麦)0.152±0.00612.792±1.9110.084±0.005郑麦9023(白麦)0.068±0.00311.898±1.3530.040±0.003川麦107(白麦)0.151±0.00613.650±0.9280.070±0.006云麦42(红麦)0.069±0.00411.092±1.5400.031±0.004云麦59(红麦)0.122±0.00912.439±0.8470.046±0.001平均0.10811.900.051品种间极差0.0844.090.053

2.2.3 国产小麦品种麸皮结构层中的总磷含量

国外学者一般以植酸作为麦麸糊粉层的标示物。研究表明，麦麸中80%以上的磷以植酸形式存在，且富集在糊粉层中[8, 20, 21]；同时，与植酸测定相比，磷含量测定相对简单，且测定精度较高。因此，采用总磷代替植酸作为麦麸糊粉层的定量标示物。由表5可知，糊粉层中总磷含量最高，约为外果皮和中间层中含量的20倍。总磷可作为定量计算糊粉层的标示物。

表5 小麦麸皮各个结构层中总磷含量/mg/g

2.3 小麦麸皮结构层的定量方法验证

根据麦麸各结构层标示物成分汇总结果(表6)，建立麦麸结构层的定量方法。

中间层比例= [ARs]样品/[ARs]中间层×100%

糊粉层比例= [P]样品/[P]糊粉层×100%

胚乳比例= [淀粉]样品/[淀粉]胚乳×100%

外皮层比例= 100%-中间层比例-糊粉层比例-胚乳比例

式中：ARs为总烷基间苯二酚含量；P为总磷含量。

表6 小麦麸皮各结构层中标示物含量汇总

根据公式计算白麦(济麦22)和红麦(云麦59)的麦麸各结构层的相对比例，与手工剥离的样品进行对比，验证结果见图5。济麦22的标示物法计算所得糊粉层比例与手工剥离的比例相当，云麦59的标示物法计算得糊粉层比例较手工比例高2.8%，主要是因为所测的总磷中包含外果皮和中间层中的磷含量造成的。总体上糊粉层的比例与真实值的偏差为6%左右，非糊粉层部分与手工剥离结果的偏差小于10%(分别为7.1%和7.2%)。不同品种中小麦成分差异较大，可能也会影响标示物法的准确性。Hemery等[6]、Antoine等[7]和Ross等[22]曾利用标示物法定量研究过欧洲小麦麸皮结构层比例。结果表明，标示物定量的准确性与小麦品种具有较大相关性，但可以较为准确的定量结构层的比例。以所测定的标示物含量平均值作为标准，可以较为准确定量国产小麦品种中麦麸结构层的添加比例。

图5 麦麸结构层比例(济麦22和云麦59)的标示物法定量结果与手工剥离结果的对比

3 结论

对6种国产小麦籽粒中的麦麸结构层手工比例、显微结构观测和标示物成分分析，结果表明，国产小麦品种中麦麸及其结构层的比例与国外小麦相似，麦麸结构层比例的品种间差异较小。其次，外果皮、中间层和糊粉层的显微结构具有明显区别，可以通过光学或荧光显微镜定性判定麦麸颗粒的大致添加量、组成和剥离情况。与外国小麦品种相似，国产小麦品种麸皮的ARs主要富集在中间层中，平均含量为11.9 mg/g，小于国外小麦品种中含量；国产小麦中糊粉层中磷的平均含量达28.7 mg/g，约为非糊粉层中磷含量的20倍，可以用于定量标示糊粉层的含量；p-香豆酸、阿魏酸及阿魏酸二、三聚体虽然在外果皮中有一定的富集性，但不足于作为准确定量外果皮的标志物。ARs和总磷可分别作为定量中间层和糊粉层的标示物，而外果皮的含量可间接计算获得。以本文所获方法和数据，可以较为准确地定性和定量判定国产全麦产品的真伪和麦麸的相对添加比例。