采用液相色谱－串联质谱法准确测定原料奶中的舒巴坦

穆姣姣 崔相勇

舒巴坦是一种典型的竞争性不可逆的β-内酰胺酶抑制剂，与β-内酰胺环类抗生素联合应用，通过对酶的抑制，保护抗生素免受破坏，提高抗菌活性，被广泛应用于医疗行业。由于原料奶中的青霉素类抗生素残留量有限量要求，因此为消除这种青霉素类抗生素残留，不法商贩向原料奶中添加β-内酰胺酶来降解抗生素；而为了逃避质检机构对β-内酰胺酶的检测，商贩极有可能向原料奶中添加舒巴坦，来抑制β-内酰胺酶活性。为保证乳制品质量安全和保障消费者的身体健康，建立原料奶中舒巴坦的准确快速检测方法是十分必要的。

本文采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/ MS）来测定原料奶中的舒巴坦，沉淀蛋白试剂为甲醇，以乙腈及0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，经过反相色谱分离后以多反应监测模式（MRM）进行检测。

一、材料和方法

1.仪器。API 4000型三重四极杆质谱仪，配有Analysis1.4.2软件处理系统，美国Sciex公司；与之联用的LC-20A液相色谱仪（包括自动进样器、二元输液泵及柱温箱），日本岛津公司。

2 .药品及试剂。舒巴坦标准品（含量89.7%），批号：130430-200906，购自中国药品生物制品检定所。实验室用水为一级水。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

3.标准储备溶液。精密称取舒巴坦0.1000g，置于100mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，作为标准储备溶液。此标准储备溶液每毫升相当于1.0mg舒巴坦。

4.质谱条件。仪器配有ESI电喷雾离子化源；离子喷射电压：-3000V；源温度：550C；源内Gas1压力：60psi，Gas2压力：60psi；气帘气压力：15psi；均为氮气。负离子模式检测；舒巴坦的碰撞能量（CE）为-20eV，解簇电压（DP）为-36V；用于定量分析的离子对为m/z231.8-m/z139.9。

5.色谱条件。色谱柱：Symmetry C18柱，3.5μm，150×2.1mm I.D.，waters公司；流动相：B（乙腈）-A（含0.1%甲酸）；进样量：20μL；柱温：25C；流速：0.3mL/min。梯度洗脱条件：0-1min，5%B；1-3min，5%-98%B；3-4.5min，98%B；4.5-5min，98%-5%B。

6.原料奶样品的预处理。称取原料奶样品5g（精确至0.01g），加入15mL甲醇，涡旋沉淀蛋白1min；转移并定容于25mL容量瓶中，震荡1min后，置于超声波中超声提取15min；转移至50mL离心管中，10000r/min离心10min；取上清液经0.22μm有机滤膜过滤，取20μL供LC-MS/MS分析。

7.空白原料奶萃取液制备。选择未添加舒巴坦的原料奶，按步骤6提取，进行LC-MS/MS分析，以确定在舒巴坦色谱出峰处不存在干扰。

二、结果

1.色谱行为和专属性。按上述步骤6操作，分别制备空白原料奶样品、空白原料奶加入舒巴坦标准溶液（相当于含10μg/kg舒巴坦）进行测试。色谱图分别见图1-A和图1-B，舒巴坦色谱出峰处不存在干扰，内源性物质不干扰测定。

2.线性范围和检出限。取空白原料奶萃取液，依次加入适量舒巴坦标准系列溶液，配制成相当于浓度为2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg的萃取液，按上述步骤6操作，进样分析；以舒巴坦峰面积为纵坐标，舒巴坦浓度为横坐标，进行回归运算，求得拟合方程为y=4830x-2910，即为标准曲线，相关系数为0.9981。由此可见，舒巴坦在2μg/kg-50μg/kg范围内线性良好，方法检出限为2μg/kg（此时信噪比S/N=3）。

3.精密度和回收率。制备相当于含舒巴坦2μg/kg、10μg/kg、50μg/kg的低、中、高3個浓度的原料奶样品，按上述步骤6的操作方法进行处理，每浓度六样本分析，同时做标准曲线，以当时的标准曲线计算样品的测得浓度，计算得出本法的精密度与回收率。低、中、高3个浓度的回收率范围分别为91.56%-96.1%、93%-98.4%和92.5%-100.2%，均在85%-115%之间；精密度RSD分别为5.4%、3.9%和6.6%，均小于10%。

三、讨论

1.质谱条件优化。（1）将浓度为200ng/mL的舒巴坦标准溶液吸入注射器，置于蠕动泵进样器上，设置蠕动泵以25μL/min的速度进样来优化质谱条件，使舒巴坦响应信号最高。分别选择舒巴坦在正、负两种离子化模式下进行扫描，比较响应值，结果发现负离子化效率高于正离子化效率，且负离子响应较为稳定，因此使用负离子扫描模式。（2）经过Q1全扫描，发现m/z231.8的响应信号最高，作为舒巴坦定量分析的母离子，在子离子扫描模式（MS2）下，可得到一些碎片离子，其中m/z139.9响应最高，其次是m/z63.9，在MRM扫描模式下，选择m/z231.8 → m/z139.9用于舒巴坦的定量分析。（3）在蠕动泵持续进样的条件下，对解簇电压、碰撞能量、离子源参数进行进一步优化，使得舒巴坦响应值达到最佳。

2.色谱条件优化。为了减少原料奶中内源性物质对测定产生干扰，需将其与舒巴坦进行色谱分离，所以需对色谱条件进行选择及优化。在质谱分析常用的流动相条件下，舒巴坦在小粒径的C18色谱柱上都可以得到较好的保留，试验中选择了Symmetry C18柱（3.5μm，150×2.1mmI.D.）。LC-MS/MS反相色谱分析方法中用到的有机相主要为乙腈和甲醇，选用乙腈作为有机相时，舒巴坦的色谱行为较好。为了改善舒巴坦峰形，选择了0.1%的甲酸作为水相。

3.提取条件的选择。试验中采用有机试剂沉淀体系，操作简单，考察了甲醇和乙腈作为沉淀试剂的沉淀蛋白效果。采用乙腈作沉淀试剂，在稀释5倍下能获得良好的沉淀效果，但舒巴坦峰形较差；采用甲醇作沉淀试剂，沉淀蛋白效果良好，同时改善了峰形。此外，超声提取的使用会提高舒巴坦的提取效率。