纳米孔测序技术在食品微生物检测中的应用

张彦斌 郭莉 靳志敏 王月 张宏博

摘 要：纳米孔测序技术因低成本、快捷与可测长片断DNA等优势备受重视，其发展较为迅速。纳米孔测序技术是将电信号作为基础的物理方法测序，大量研究人员使高通量测序技术在食品微生物研究中使用，但是在食品微生物检测中使用纳米孔测序技术中使用研究比较少。以此，本文就对此方面进行研究。

关键词：纳米孔测序；微生物检测；食品检测

随着人民生活质量的提高，消费者对于食品质量安全尤为重视。食品污染的主要来源为微生物污染，影响了食品质量的安全性，对消费者健康造成危害，要利用有效监测方法实现监测。利用传统培养方法检测虽然效果良好，但是操作的过程较为复杂，培养的时间较长，无法满足快速监测需求。目前，为了进一步提高检测效率，研究人员在食品微生物检测中使用了分子生物学技术，尤其是食源性致病菌检测。常用的分析生物技术包括DNA序列分析技术、基因芯片技术、核酸探针技术等。DNA序列分析技术是基于基因水平实现的食品微生物的分析与鉴定，排除了检测中的干扰因素。在技术的不断发展中，DNA测序技术也得到了发展，纳米孔测序技术为新型第三代DNA测序技术[1]。以此，本文就对在食品微生物监测中使用纳米孔测序技术进行分析。

1 纳米孔序列技术的分析

从嵌入溶血素蛋白通道对血脂的作用研究开始，研究人员在十年前就把开发并且探索了各种类型纳米孔。α-溶血素属于能连接到细胞膜中继而导致细胞溶解的蛋白质，在模型中，一层生物膜将溶液划分成两个区域，α-溶血素蛋白嵌入到生物膜中，构成纳米孔。在DNA分子穿越纳米孔的时候，会改变阻断电流，此时利用灵敏电子元件检测电流变化。但是，因为4种碱基的理化性质较为接近，序列读取比较困难。另外，降低电子噪声是一个挑战，利用降低DNA位移速率能够降低部分噪声。新出的新形式仿生纳米孔包括仿生核孔复合物与丝蛋白毛孔，跨孔形成的侧电极使利用纳米孔转运的生物分子的电子检测成为可能。使用等离子体减薄仪与离子束雕刻技术得出超薄纳米孔，利用耦合到纳米孔的扫描探针显微镜，证实利用此静电效应与场效应能够代替检测方式可行性[2]。

DNA酶能够结合DNA链，但其作用酶催化反应速度的限制，速度达到每个核苷酸几个ms级别。相关研究表示，利用DNA外切酶Ⅰ切下核苷酸，基于电压驱动，利用α-HL纳米孔实现区分，甚至包括甲基化dCMP。虽然能够区分核苷酸，但是还是要对以下内容进行优化：①优化DNA外切酶Ⅰ，使其能够在高压条件下工作；②对外切酶和纳米孔距离进行控制，正确检测切下来的顺序；对DNA外切酶Ⅰ切割速度，使酶切速度统一[3]。

2 纳米孔序列的分类

根据不同的纳米孔来源，DNA序列纳米孔包括固态、生物两种纳米孔。生物纳米孔工作原理详见图1，将高盐溶液添加到检测池中，在纳米孔两端设置电场，在单链DNA分子没有通过纳米孔时，会出现恒定电流。在单链DNA分子通过纳米孔时，电流会降低，导致阻断电流信号的出现。通过放大电流信号，使其朝着数字信号转变。由于碱基的不同，所出现的阻断电流信号也不同，通过不同的阻断电流信号，对DNA碱基序列进行识别。生物纳米孔大部分为生物体内天然存在的故有纳米器件，具备生物活性、孔径结构与功能，由于能够进行自由的分子设计与生物修饰，备受科学家重视。现代所常用的生物纳米孔具备α-溶血素与耻垢分枝杆菌空蛋白A，详见图2[4]。

固态纳米孔是由硅和其衍生物构成，都是利用离子束或者电子束钻出纳米尺度孔洞，之后进行孔大小与形状的修饰。DNA分子与蛋白复合物利用纳米孔导致阻塞电流差异，相关人员检测了RNA与DNA聚合酶复合物、SSB蛋白-DNA复合物[5]。固态纳米孔径能够控制，能够应用到DNA结合蛋白和DNA结合药物的筛選中，还能够对与DNA特异位点结合的蛋白质判断。寡聚核苷酸修饰之后的蛋白质与多肽能够基于电场驱动，通过寡核苷酸引导过孔，并且解链蛋白促进了蛋白质结构的解析研究。

3 食品微生物检测中的纳米孔测序技术

分子生物学的发展改变了食品微生物的研究，代谢组学、功能基因组学、蛋白质组学等并不依赖微生物培养技术，在食品微生物监测中逐渐使用。高通量测序技术NGS也在食品微生物菌株测序检测中使用，为研究人员探索食品安全提供了全新的研究方法。DNA测序技术不仅应用到研究微生物多样性与基因组学中，还能够应用到单个基因DNA序列的分析中，单一基因DNA序列可在食品微生物种类鉴定分析中使用。徐宝红[6]等人利用PCR-焦磷酸测序制定基因测序，鉴定副溶血性弧菌。另外，还有研究人员也使用此方法对对16株肠炎沙门菌进行了鉴定。徐宝红等人利用PCR0焦磷酸测序方法，使用测得的DNA序列通过BLAST对目标菌基因组序列进行分析和对比，确定是否存在目标菌。微生物基因组为BLAST分析基础，只有越来越多的微生物基因测序被测定出来，此分析方法的适用范围才会覆盖大量的微生物种类。随着微生物基因组学的持续发展，基因组测序食品微生物数量也在不断的增加。

肉毒素为肉毒杆菌所产生的分子神经毒素，具有较强的毒性，致死量为1ng/kg体重。因为肉毒素能够利用食物链传播，对人类的安全造成严重危害，所以也被应用于生化武器。目前，肉毒素中的ABEF会对人类造成危害，毒害机理为抑制神经末梢释放乙酰胆碱，导致肌肉松弛麻痹，最终因呼吸肌麻痹死亡。纳米孔技术为新型超灵敏快捷检测手段，可在蛋白质、多肽分析中使用。纳米孔能够利用酶切反应的水解多肽分析研究蛋白酶功能，图3为肉毒素B的分子结构，在Zn2+条件下，肉毒素B能够酶切神经细胞突出蛋白，剪切位为76-77位氨基酸，生成C端sb2（77-93）与N端 Lp-sb2两个片断。所以，通过对两个蛋白片段的纳米孔过孔信号进行分析，就能够间接检测肉毒素B。实验结果表示，以酶切后sb2（77-93）为生物标记物，分析纳米孔的过孔信号，在几分钟内就能够对低于500pmol/L的有活性的肉毒素B进行检测，此方法在血清样本体系分析中具有良好的效果。

随着DNA测序技术的不断发展，测序所需时间不断缩短，花费成本也在不断降低。MinION为第一款正式量产的纳米孔测序仪，体积比普通U盘要大。其默认运行时间为48 h，运行2 min所产生的数据能够在相应分析中使用，每秒可识别250个碱基，平均读长为13～20kb。Menegon等人利用600个碱基DNA序列对热带雨林中野生蛙类具体种类进行分析，序列错误率为 5%～10%。提高了测试深度，能够使MinION测序精准率达到98%[7]。

4 结语

利用纳米孔测序技术检测食品微生物的成本比较低，并且能够提高检测速度。测序芯片使用寿命比较长，使纳米孔测序方便应用到食品微生物检测中。相信在今后的研究中，通过学者的努力，能够研发更加稳定的生物纳米孔，解决识别率低、速度过快等问题，对纳米孔测序技术进行完善，使检测的稳定性得到提高。

参考文献

[1]周彪，石彪，于乐泳，等.用于固态纳米孔制备的单层WS2薄膜转移技术[J].微纳电子技术的研究[C].//第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会议论文集，2017.

[2]孫珊珊.离子液体调控ssDNA在生物纳米孔中穿孔速度的研究[C].//中国化学会[C].//第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集，2017.

[3]武灵芝，董帅.介电泳技术在生物信号检测和相分离阻变材料中的应用[J].中国科学：技术科学，2016，12（3）：74-75.

[4]胡颖，周智，单欣岩，等.固态纳米孔中DNA分子再捕捉的探测和分析[J]. 科学通报，2015，21（4）：423-423.

[5]王冕.面向第三代纳米孔基因测序技术的DNA摩擦学行为研究[D].成都：西南交通大学，2015.

[6]徐保红，李秀娟，杨芳，等.PCR-焦磷酸测序法快速鉴定副溶血性弧菌.预防医学情报杂志，2011，27（1）：78-80.

[7]Menegon.nanoelectrodes for DNA molecule detection [J]. Nanotechnology and Precision Engineering，2016，05（05）：78.

基金项目：内蒙古自治区科技重大专项（编号：ZDZX2016016）；内蒙古自治区科技创新引导奖励资金项目（2017年度）；内蒙古自治区科技创新引导奖励资金项目（编号：KCBJ20 18068）。

作者简介：张彦斌（1983—），男，内蒙古呼和浩特人，硕士，微生物检验师。研究方向：食品质量与安全。

通讯作者：张宏博（1986—），男，内蒙古巴彦淖尔人，博士，工程师。研究方向：食品质量与安全。