功能菌液对窖泥转化的影响研究

刘多涛 ，罗青春，乔宗伟，2，李 智，施 思，雷学俊，张 霞，郑 佳

（1.宜宾五粮液股份有限公司,四川宜宾 644007；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644007）

中国白酒因其独特的口感与香气被誉为世界六大蒸馏酒之一，浓香型白酒作为传统白酒四大香型之一，占有举足轻重的地位[1]。从浓香型白酒的生产环节来看，酿酒微生物来源十分广泛，包括大曲、窖泥、车间空气、生产器械、生产用水及物料混配的场地等，其中大曲和窖泥是浓香型白酒酿造微生物的主要来源。

在我国传统浓香型白酒酿造过程中，窖池是基础，是多种微生物生长和繁殖的载体，是我国浓香型白酒生产的关键设备。在长期的固态发酵、续糟工艺操作以及窖池周期闭合的影响下，窖池微生态环境不断发生菌群演替，形成复杂的微生物多样性。正是由于这些有益功能菌的大量生长、繁殖、代谢以及相互协调作用，才赋予了白酒的独特香型，造就了以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒的典型风格[2]。窖池微生物群落结构决定着窖池的质量，而窖池质量左右着传统白酒生产质量和风格的稳定性。

本试验在传统人工窖泥培养的基础上，通过以黄水为主要原料的培养基，培养协调而全面的老窖泥功能微生物菌群并应用于小窖池发酵过程。以期为窖池的转化提供重要依据，从而为浓香型白酒质量及产量的提升研究打好理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

窖池：车间正常生产窖池；黄水：车间生产用窖池黄水。

培养基：稀释10 倍黄水中，添加0.5%酵母膏、0.1%葡萄糖、6%酒样（按纯酒精计），1 mol/L 氢氧化钠调pH值调至5.0。

耗材：细菌宏基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工）；古菌宏基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工）；细 菌：341F 引 物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCC TACGGGNGGCWGCAG；805R 引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC；古菌：349F 引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNGYGCASCAGKCGMGAAW；806R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGG -TATCTAAT。

1.2 实验方法

1.2.1 功能菌液培养

在1.1 培养基中接入老熟窖泥，接种量为10%，35 ℃静置培养5 d。

1.2.2 有机酸检测

对培养好的功能菌液的有机酸进行检测，运用衍生化法进行检测，具体检测方法见曹云刚[3]等。

1.2.3 微生物群落结构分析

1.2.3.1 基因组DNA提取

采用差速离心法收集微生物细胞沉淀[4]，采取反复冻融与试剂盒相结合的方法，收集DNA，置于-20 ℃保存；利用Qubit2.0 DNA 检测试剂盒对基因组DNA 精确定量，以确定PCR 反应加入的DNA量。按照产品说明书进行操作。

1.2.3.2 PCR扩增

利用引物341F 和805R 对菌液细菌基因组16S rDNA V3—V4 进行扩增，利用引物349F 和806R 对菌液古菌基因组16S rDNA V3—V4 进行扩增。扩增体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L each）0.5 μ L，DNA 10 ng，引 物F（50 μmol/L）0.5 μL，引物R（50 μmol/L）0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL。扩增程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，45 ℃20 s，65 ℃30 s，共5 个循环；94 ℃20 s，55 ℃20 s，72 ℃30 s，共20 个循环；72 ℃5 min。

1.2.3.3 DNA纯化及高通量测序

DNA 纯化及高通量测序由上海生工有限公司完成。利用Qubit2.0 DNA 检测试剂盒对回收的DNA 精确定量，以方便按照1∶1 的等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA 量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol。高通量测序数据主要采用Mothur 和Excel 软件进行统计和分析，将相关序列提交NCBI数据库进行BLAST同源性比较。

1.2.4 试验新窖池应用

用喷壶把培养好的功能菌液均匀喷洒在试验的小窖池，喷洒位置为窖池底部和壁下层。

2 结果与分析

2.1 有机酸分析（表1）

表1 发酵液有机酸含量分析 (mg/100 mL)

将培养好的功能菌液进行有机酸检测，结果见表1。由表1 可看出，空白样中己酸与乳酸含量分别为6.13 mg/100 mL 和373.4 mg/100 mL，发酵液己酸与乳酸含量分别为389.2 mg/100 mL 和20.73 mg/100 mL，该培养液能产生大量的己酸，并有显著降解乳酸的作用。而己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯被称为四大酯类。其中，己酸乙酯是浓香型白酒的主体香，其重要前体物质就是己酸，它在白酒中具有重要的呈味作用。

2.2 功能菌液微生物群落结构分析

2.2.1 测序序列数目和多样性指数分析

为进一步清楚地了解菌液的微生物群落结构，对菌液细菌和古菌的16S rDNA V3—V4 区进行高通量测序分析，结果表明，Coverage 指数即取样覆盖率均超过97%，样品稀释曲线见图1。从图1 可知，样品随着测序序列数的增加，当reads 数超过5000 后，多样性指数曲线趋于平坦，说明本次试验取样合理，结果能代表样本的真实情况。

图1 样品稀释曲线

2.2.2 功能菌液细菌多样性分析

对样品中微生物多样性进行分类分析，可以知道样品中含有何种微生物及各微生物的相对丰度。为了展示效果，一般只显示相对丰度前50 的微生物分类，剩余合并为other。

图2 功能菌液细菌群落结构

如图2 所示，发酵液细菌群落中，梭菌属（Clostridium）为绝对优势菌群，占比为51.36%，而梭状芽孢菌属（Clostridium sensu stricto）和Garciella的比例分别为21.73%和8.48%。在窖泥微生物群落中，厌氧梭菌一直被认为是白酒风味物质形成的重要微生物，如Clostridium kluyveri、产丁酸梭菌（C.butyricum）和酪丁酸梭菌（C.tyrobutyricum）等，能产生特征香气物质己酸乙酯、丁酸乙酯的前体物质己酸、丁酸等[6]。刘博等[7]研究表明，浓香型白酒中主要窖泥臭味物质4-甲基苯酚的主要微生物来源是梭菌属。

2.2.3 功能菌液古菌多样性分析

如图3 所示，发酵液古菌群落中，甲烷囊菌属(Methanoculleus)为绝对的优势菌，占比为76.01%，而热裸单胞菌属（Thermogymnomonas）和甲烷杆菌属（Methanobacterium）的比例则依次为16.43%和6.8%。

图3 功能菌液古菌群落结构

2.3 试验小窖池窖泥变化

对比了小窖池窖底泥试验前后的颜色，水分和pH 值差异，结果见表2。功能菌液应用于小窖池后，窖底泥从黄色变为了灰色，水分均有增加，pH值均有所升高，越接近于中性。说明能较好的改变小窖池的窖底泥。

3 讨论

本研究以黄水为主要原料设计了创新的培养基，用以富集老窖泥功能菌群，此菌液具有产生高浓度己酸的作用，并且在喷淋至窖泥后一定程度上促进了窖泥感官特征和pH 值的转化，这可能与其中含有大量的厌氧梭菌和甲烷菌群有关，金城[8]研究表明，梭菌对于泸型酒中己酸乙酯等典型风味物质的形成具有重要作用。薛正楷等[9]筛选出了1 株具有高效产己酸特性的梭菌，栗连会[10]从窖泥中分离到了降解乳酸的梭菌属等菌株。发酵液中的优势菌群甲烷囊菌属(Methanoculleus)是四川地区浓香型白酒窖泥的主要功能甲烷菌之一[11]，属氢营养性甲烷菌，能够利用氢气和甲酸作为底物产生甲烷，常与梭菌属细菌共生生成乙酸，丙酸等。甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）能够利用乙酸产生己酸。另外，研究表明，甲烷囊菌属、甲烷杆菌属和甲烷八叠球菌属在10 年以上窖泥中丰度较高，尤其是甲烷八叠球菌属在25 年以上老窖泥中丰度会进一步提高[12]，说明其在老窖泥中的重要作用。

表2 试验小窖池窖底泥物理特性变化

由于浓香型白酒窖泥质量随窖龄延长在不断地变化，不同方式培养的窖泥变化速度有差异；同时不同季节和不同入窖条件对产酒质量也有一定的影响。因此该试验只是在功能菌液对窖泥老熟转化方面进行初步探索，进一步探索功能菌液对窖泥的长期影响将是重要的课题。