儿童朗格罕细胞组织细胞增生症BRAFV600E突变对预后的影响

崔 蕾 张 莉 廉红云 王一卓 武万水 王天有 李志刚 张 蕊

朗格罕细胞组织细胞增生症(LCH)是一类以朗格罕细胞异常克隆性增生和聚集并导致组织损伤为特点的组织细胞疾病，好发于幼年儿童[1]，临床表现复杂多变，轻者表现为自限性的单纯骨或皮肤损害，重者可累及多个危险器官甚至危及生命[2]。目前主要采用联合化疗治疗LCH，患儿对化疗的反应和预后有很大差异，治疗过程中容易复发，还可能遗留尿崩症、肝硬化、神经元退行性变等终生后遗症，属于儿科血液系统疑难罕见病之一[3]。近年来的研究发现，50%～65%的LCH患者中存在B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BRAF)的V600E突变(BRAFV600E)[4,5]。BRAFV600E突变在LCH预后中的意义尚存争议。本研究在LCH患儿中探讨了BRAFV600E突变与临床特征和预后的相关性，并分析影响儿童LCH的预后因素。

1 方法

1.1 研究设计 回顾性纳入首都医科大学附属北京儿童医院(我院)收治的LCH患儿，对患儿病灶组织进行BRAFV600E突变检测，分析BRAFV600E突变与临床特征和预后的相关性，单因素和多因素分析影响儿童LCH预后的因素。

1.2 伦理 本研究方案获首都医科大学附属北京儿童医院(我院)伦理委员会的审批(2020-k-16)。

1.3 纳入标准 同时满足以下标准时纳入：①2016年1月1日至2017年12月31日我院收治的LCH患儿，病灶活检病理免疫组化染色CD1a阳性和/或CD207阳性；②年龄<18岁；③病灶组织进行了BRAFV600E突变检测；④取得患儿(8岁以上)及监护人同意，并签署书面知情同意书。

1.4 排除标准 满足以下任一项者排除：①确诊后未按照我院规范化诊疗方案进行系统化疗；②入我院前接受过抗肿瘤治疗。

1.5BRAFV600E突变检测 采用数字PCR方法检测病灶组织中的BRAFV600E突变。采集患儿诊断时病灶活检组织石蜡包埋的10 μm×5 μm未染色切片，采用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen, Netherlands)提取基因组DNA，储存于-80 ℃冰箱待用。采用QX200TM液滴数字PCR系统(Bio-Rad, Hercules, CA)检测，引物和探针序列如下(5’-3’)，正向引物：CATGAAGACCTCACAGTAAAAATAG-GTGAT，反向引物：TGGGACCCACTCCATCGA，野生型探针(HEX标记)：CTAGCTACAGTGAAATC，突变型探针(FAM标记)：TAGCTACAGAGAAATC。20 μL反应体系包括：1×dd PCR Supermix for Probes(No dUTP, Bio-Rad), 250 nM探针和900 nM引物及DNA模板12 ng。反应条件：95℃ 10 min，然后95℃ 50 s和58℃ 90 s，共40个循环，最后70℃ 5 min。结果采用Quantasoft分析软件(Bio-Rad)分析。阳性对照采用Tru-Q7(1.3% Tier)参考标准DNA(Horizon Discovery, Lafayette, USA)，阴性对照经过知情同意后采用健康志愿者外周血基因组DNA。所有样本重复检测3次。检测敏感度为0.1%。

1.6 疾病分型 LCH根据受累器官/系统分为单系统型(SS)和多系统型(MS)，MS-LCH根据有无“危险器官”(肝、脾、造血系统)受累分为无“危险器官”受累(MS RO-)和有“危险器官”受累(MS RO+)[6]。

1.7 治疗方案 采用我院BCH-LCH-2014方案，主要参考国际组织细胞协会LCH-Ⅲ和LCH-S-2005方案[7,8]。分层治疗方案如下。①一线治疗：泼尼松和长春新碱，每疗程6周，1或2个疗程；②二线治疗：阿糖胞苷和/或克拉屈滨、泼尼松和长春新碱，每疗程4周，共4或8个疗程；③维持治疗：泼尼松、长春新碱(SS和MS RO-)，泼尼松、长春新碱和6-巯基嘌呤(MS RO+)；总疗程半年或1年，具体治疗方案见参考文献[9]。

1.8 疾病状态评定 患儿在治疗前、一线治疗第6周、12周、25周、52周、二线治疗第4疗程、第8疗程末进行评估，维持治疗每3个月评估1次，评估内容包括病史、体格检查、实验室检查(血常规、生化、尿渗透浓度及内分泌检查等)和受累部位的影像学检查等。①疾病无活动(NAD)：即痊愈，所有症状和体征完全消退，影像学检查恢复正常；②疾病活动(AD)：好转，即部分病灶好转，没有病灶加重或新发病灶；③混合：部分病灶好转，部分加重或出现新发病灶；④稳定：原有病灶无好转或加重，无新发病灶；⑤进展：原有病变进展和/或出现新发病灶；⑥复发(再激活)：为患儿获得痊愈或维持治疗3个月以上持续好转后再次出现新发病灶。治疗反应分为良好(包括NAD、好转)、中等(稳定、混合)和不良(进展、复发)[8]。一线治疗第6周反应率指治疗反应为良好的比例。

1.9 随访

1.9.1 随访内容 患儿停药后3个月、6个月、1年、2年、3年和5年分别进行随访。随访内容包括生存情况、疾病状态评定和不良事件(进展、复发、后遗症、死亡)发生。本研究随访截至2019年12月31日。

1.9.2 事件评估 ①无进展生存(PFS)：由诊断之日至出现进展或复发或死亡之日。②无事件生存(EFS)：由诊断之日至发生事件(进展、复发、持续性后遗症或死亡)之日。③总生存(OS)：由确诊之日至各种原因导致的死亡之日。

1.10 统计学分析 应用IBM SPSS 25.0软件包(IBM Corporation，Armonk, NY, USA)进行分析。采用精确概率法χ2检验比较BRAFV600E突变阳性组和阴性组在临床特征方面的差异。两组连续变量如年龄的比较采用非参数Mann-Whitney检验。采用Kaplan-Meier法分析生存率，Log-Rank检验比较各组间生存率差异，Kaplan-Meier法进行单因素的预后分析，Cox回归分析模型进行多因素分析。检验显著性取α=0.05，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 研究期间我院共收治250例LCH患儿，排除无足够的病灶组织行BRAFV600E突变检测88例、确诊后未按照我院规范化诊疗方案进行系统化疗17例、入我院前接受过其他抗肿瘤治疗5例，最终140例患儿纳入本文分析。140例患儿中BRAFV600E突变阳性率为67.1%(94例)。临床分型为SS 60例(42.9%)，MS RO-47例(33.6%)，MS RO+33例(23.6%)。表1显示，诊断时中位年龄为2.2(0.1～15.7)岁，男89例(63.6%)，女51例。受累部位最常见为骨，其次为危险器官、皮肤、耳、肺、眼部、垂体、淋巴结、口腔、中枢神经系统、副鼻窦、胃肠道、纵膈、甲状腺和腮腺。危险器官以肝受累最常见，其次为脾和骨髓。110例患儿首先进行了一线治疗，并在第6周进行治疗反应评估，总体第6周反应率为42.7% (47/110)。

表1 140例儿童朗格汉细胞组织细胞增生症不同临床特征中BRAFV600E突变的阳性率比较[n(%)]

中位随访时间34.1(0.9～50.7)月，随访期内48例(34.3%)出现进展；40例(28.6%)出现复发；12例(9.6%)出现持续性后遗症，其中9例尿崩症、2例肝硬化、1例双侧脑室脱髓鞘病变；死亡3例(2.1%)，其中1例因合并重症肺炎、纵膈气肿、呼吸衰竭死亡，1例因肝硬化、门静脉高压、多脏器衰竭死亡，1例因继发噬血细胞综合征和重症感染死亡。总体3年PFS、EFS和OS分别为(48.9%±4.5%)、(46.6%±4.4%)和(97.8%±1.2%)。

2.2BRAFV600E突变与临床特征的相关性 表1显示，BRAFV600E突变与患儿临床分型相关，MS RO+患儿突变阳性率(90.9%)高于MS RO-(53.2%)或SS患儿(65.0%)，差异有统计学意义；危险器官肝、脾、骨髓受累患儿的阳性率高于非危险器官受累患儿；皮肤受累患儿的阳性率改与非皮肤受累患儿，差异均有统计学意义。

2.3BRAFV600E突变与预后的相关性 表1显示，BRAFV600E突变与患儿的进展/复发相关，突变阳性患儿进展/复发率(57.4%)高于突变阴性患儿，差异有统计学意义，后遗症和死亡的发生率差异无统计学意义。

图1显示，3种临床分型患儿的预后(3年PFS、EFS和OS)差异均有统计学意义(图1A～C)。进一步分析每种临床分型中BRAFV600E突变的预后，BRAFV600E突变阳性和阴性患儿的预后差异均无统计学意义(图1D～J)。

图1 儿童朗格汉细胞组织细胞增生症中BRAFV600E突变阳性和阴性患儿的预后比较注 A:不同临床分型:[单系统组(SS)、多系统无危险器官受累组(MS RO-)和多系统有危险器官受累组(MS RO+)]患儿的3年无进展生存(PFS);B:不同临床分型患儿的3年无事件生存(EFS);C:不同临床分型患儿的3年总生存(OS);D:SS LCH中突变阳性和阴性患儿的3年PFS;E:SS LCH中突变阳性和阴性患儿的3年EFS;F:MS RO-LCH中突变阳性和阴性患儿的3年PFS;G:MS RO-LCH中突变阳性和阴性患儿的3年EFS;H:MS RO+ LCH中突变阳性和阴性患儿的3年PFS;I:MS RO+ LCH中突变阳性和阴性患儿的3年EFS;J:MS RO+ LCH中突变阳性和阴性患儿的3年OS(因SS和MS RO-组所有患儿的3年OS均为100%,未做突变阳性和阴性患儿的3年OS差异分析)

表2显示，单因素分析显示，BRAFV600E突变、诊断时年龄和受累部位(皮肤、危险器官、垂体和耳)是影响儿童LCH预后的因素。多因素分析结果显示，危险器官受累是影响儿童LCH 3年PFS的独立预后因素(HR=2.702，P=0.003)，垂体受累(HR=3.582，P<0.001)、危险器官(HR=2.321，P=0.008)和耳部受累(HR=2.093，P=0.013)是3年EFS的独立预后因素。BRAFV600E突变并非儿童LCH的独立预后因素(PFS：HR=1.425，P=0.254；EFS：HR=1.721，P=0.077)。

表2 单因素和多因素分析影响儿童朗格罕细胞组织细胞增生症预后的因素

注 HR：风险比

3 讨论

LCH是一类高度异质性的罕见疾病，临床表现和患儿对治疗的反应差异较大，BRAFV600E突变是儿童LCH中最常见的突变，因此，探讨该突变在LCH中的预后意义对于临床治疗具有重要的指导价值。BRAF基因位于人7号染色体7q34，编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)等信号通路中起关键作用，影响细胞的分裂、分化和分泌等重要生物学过程[10]。BRAF基因第15号外显子上的点突变c.1799T>A p.V600E是最常见的突变，多发生于恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结肠癌等肿瘤，并与肿瘤进展/复发、预后差密切相关[11-13]。2010年发现一半以上LCH患者中存在BRAFV600E突变，改变了对该疾病的认识，目前认为LCH是一种髓系来源的罕见肿瘤[14,15]。然而，由于疾病的高度异质性，该突变在LCH中的预后意义仍存争议。

法国一项回顾性研究显示，315例儿童LCH中BRAFV600E突变阳性率为54.6%，突变与危险器官受累相关，并且突变阳性患儿对一线治疗的反应较差，复发率和后遗症发生率均高于突变阴性患儿[16]。国内一项纳入65例儿童和32例成人LCH的研究显示，BRAFV600E突变阳性患者的PFS较差，并且是独立预后因素之一(HR=2.38，P=0.044)[17]，然而，该研究中BRAFV600E突变阳性率仅为32.0%，患者临床分型以SS为主(91.8%)，MS RO+仅为6.1%，与本研究人群的临床特征有较大差异。在一项肺受累的成人LCH研究中，BRAFV600E突变与进展等预后指标并无明显相关性[18]。本课题组曾回顾性分析80例儿童LCH，显示BRAFV600E突变与临床表现、治疗反应及复发均无明显相关性，然而该研究样本量较小，随访时间较短，未行生存率等预后分析[19]。本研究显示，BRAFV600E突变与总体患儿的进展/复发相关，推测是因为该突变主要发生在侵袭性较强的高危LCH亚型中，而在多因素分析中，危险器官受累是影响预后的独立预后因素，从而抵消了BRAFV600E突变对预后的影响。由于LCH疾病的异质性和人种的差异，还需要更多大样本的研究加以明确。

研究显示，BRAF基因是LCH重要的驱动基因，并且BRAFV600E突变在不同细胞中发生的层级决定了LCH临床表现的差异[20, 21]；小鼠模型中，在骨髓干祖细胞表达BRAFV600E突变可导致人高危型LCH的疾病表现，而在分化成熟的树突状细胞(DC)中该突变则引起局灶性的LCH病灶[22]。本研究和其他研究都证明，高危难治型LCH中BRAFV600E突变的阳性率高，并且多为小年龄患儿，普遍对一线治疗反应差，二线治疗和补救治疗则存在较强的化疗不良反应[23]。因此，近年来针对BRAF的靶向治疗已被尝试用于这些难治/复发患儿，最新一项欧美多中心研究结果显示，采用BRAF抑制剂Vemurafenib 治疗54例难治性多系统LCH患儿，获得了较好的短期疗效，8周完全反应率达70.4%，然而，仍有80%患儿停药后出现了复发；药物不良反应(主要为皮疹)是可控的，但药物的最适剂量、疗程、长期疗效还有待于更多的大样本、前瞻性的临床试验进一步明确[24]。由于病灶组织取样较困难，一些研究通过定量检测循环血细胞或血浆中游离BRAFV600E突变，对LCH进行诊断和治疗反应评估[25, 26]。在组织BRAFV600E突变阳性患儿中，几乎所有高危LCH血细胞或血浆中的突变均为阳性，并且与治疗反应相关。本课题组研究也证实，诊断时和化疗过程中的血浆游离BRAFV600E阳性LCH患儿的PFS较差，易出现进展/复发，从而为疾病的预后判断提供了较好的指标[9]。此外，在BRAFV600E突变阴性的LCH患儿中，还发现存在其他基因的突变如MAP2K1、ARAF、ERBB3等，它们在LCH中的临床意义还需进一步阐明[27, 28]。

综上所述，本研究对儿童LCH中BRAFV600E突变的临床意义进行了分析，显示BRAFV600E突变主要发生在危险器官受累的高危患儿中，与突变阴性患儿相比，突变阳性患儿进展/复发率增加，但该突变并非是儿童LCH的独立预后因素。LCH虽然死亡率较低，但反复进展/复发已成为该病治疗失败的主要原因，尤其是对于MS LCH。