针刺结合中药对卒中相关性肺炎大鼠干预效应的实验研究

王 颖，许 丽，吴海洋，李良勇

(1.安徽中医药大学第二附属医院 脑病科，安徽 合肥 230000；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230000；3.安徽中医药大学第一附属医院 脑病科，安徽 合肥 230000)

随着社会的发展及人口老龄化，脑卒中作为一种常见的脑血管疾病，其发生率、致残率及病死率正逐年升高。据世界卫生组织报告显示，脑卒中是在世界范围内的第3位死亡原因，仅次于冠心病和癌症，在我国目前是致残率第一、致死率第二的高发疾病，严重影响患者的身心健康[1]。研究表明[2]，在脑卒中众多的并发症中，卒中相关性肺炎为最常见的并发症之一，也是导致卒中患者死亡的主要原因，其占7%～22%[3]。卒中相关性肺炎(stroke-associated pneumonia，SAP)的概念由Hilker[4]在2003年首次提出。目前关于SAP的发生机制尚不明确，其发病可能与卒中后免疫抑制状态、细菌种植、吞咽功能障碍等因素密切相关[5]。且SAP相关的危险因素有高龄、吞咽困难、神经功能缺损及合并的一些慢性疾病，如慢阻肺、糖尿病等，这些危险因素都会引起SAP的发生和加剧病情的发展。目前关于SAP的西医治疗主要以使用抗生素为主，但长期使用容易引起耐药菌的产生、机体菌群失调等不良后果。因此，如何发挥中医药特色治疗卒中相关性肺炎是本课题研究的重点，本研究拟通过针刺结合中药对SAP大鼠干预效应的实验研究，为卒中相关性肺炎的临床治疗提供依据和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取健康成年雄性SD大鼠120只，鼠龄10～12周，体重约250～280 g，大鼠均由安徽中医药大学实验动物中心提供，合格证号：svxi-[(皖)2011-007]。所有大鼠均采用统一饲养，自由饮水和进食，饲养环境温度控制在24～28 ℃之间，湿度在50%～60%，饮用灭菌自来水，房间要保持干净、通风，定时清理鼠笼。实验在安徽中医药大学动物实验中心进行。

1.2 实验药物

顽痰汤药液：陈皮、姜半夏、老鹳草、桃仁、碧桃干、全瓜蒌、苦杏仁、佛耳草、生地、川芎、炙甘草各10 g(顽痰汤为安徽中医药大学第二附属医院脑病一科治疗肺部感染的经验方)。以上中药饮片的提供来自安徽中医药大学第二附属医院中草药房。

药液制备：将所有药物饮片放入锅内，加足量水浸过药物，充分浸泡30 min后煎煮3次，滤出药液，合并药液后用水煎醇沉法制备原方提取液，浓缩药液至含生药0.82 g/mL，分装后放置4 ℃冰箱中贮存备用，给药剂量参照标准动物的体表面积等效剂量折算系数法[6]算出大鼠灌胃等效计量为：8.2 g·kg-1·d-1，中药组按46.0 g·kg-1·d-1的浓度灌胃。

1.3 主要实验试剂及仪器

金黄色葡萄球菌标准菌株、MH(A)、MH(B)培养基购自苏州北纳创联生物技术有限公司；肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素IL-18酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自武汉基因美科技有限公司；移液器购自eppendorf公司；电热恒温箱购自上海三发；离心机购自安徽嘉文；电子天平购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司；一次性针刺毫针(0.25 mm×30 mm)购自苏州天协针灸器械有限公司。

2 实验方法

2.1 实验分组

选取健康雄性SD大鼠120只，随机分为6组，即空白对照组、假手术组、模型组、针刺组、中药组、针刺结合中药组，每组各20只，空白对照组不作任何处理，假手术组只暴露颈总动脉，不阻断血管，其他4组参照改良线栓法结合滴鼻法[7]接种0.2 mL金黄色葡萄球菌菌液制备SAP模型。

2.2 菌液配制

以0.9%生理盐水配取菌悬液，用比浊仪将菌液浓度调节至1.0×108CFU/mL，并置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.3 制备SAP模型

2.3.1 脑卒中模型的制备和评价 采用参考文献[8]中的线栓法建立大鼠的脑卒中模型。制备后采用Longa5分法[9]对大鼠进行神经功能缺损评分。0分：无神经损伤症状；1分：对侧的前爪不能完全伸展；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，没有意识；5分：死亡。评分在2～3分为脑卒中模型建立成功。

2.3.2 肺炎模型的制备 采用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉脑卒中模型成功的大鼠，将其以头仰立位姿势固定，经左侧鼻腔逐滴缓慢滴入0.2 mL已配好的浓度为1×108cfu/mL金黄色葡萄球菌菌悬液(冰浴保存)，立即竖起大鼠，并将头部向上垂直左右旋转30 s，使菌液均匀分布于两肺[10]。

2.3.3 脑卒中感染肺炎后的评价 感染72 h后观察大鼠出现精神状态差、进食减少、毛色灰暗、背部弓起、耳缘静脉突起加粗，且呼吸急促，鼻唇部分泌液增多等症状。符合以上表现的大鼠则认为卒中相关性肺炎造模成功，不符合的将弃用。最终模型组和中药组各有1只死亡，针刺组有2只死亡。

2.4 治疗方法

将造模成功后的4组大鼠，称取体重并记录。空白对照组、假手术组、模型组不进行干预，同等条件下常规喂养。中药组采用46.0 g·kg-1·d-1的剂量于每日上午9时左右进行灌胃(给药前将药液加温至38 ℃左右)。针刺组自由饮水饮食，选取双侧大椎、列缺、尺泽、丰隆、太溪、足三里穴，穴位定位参照《实验针灸学》[11]，皮肤和针具常规消毒，采用一次性0.25 mm×30 mm的毫针，选定穴位后快速进针，每次留针30 min，隔15 min行针1次，1次/天。针刺结合中药组分别在针刺后予以中药灌胃，方法同针刺和中药组，每组连续治疗7天。

2.5 标本采集及检测方法

2.5.1 肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素IL-18的检测 治疗7天后，禁食12 h，腹腔麻醉大鼠，将其以仰卧位固定在操作台，剖腹，暴露腹主动脉，采用10 mL一次性注射器抽取动脉血8～10 mL，立即注入非抗凝采血管内，编号，在室温下静置2 h后离心(3 000 r/min)15 min，分离出血清并分装保存在-20 ℃低温冰箱待测。方法：按照TNF-α、IL-18 ELISA试剂盒的说明书检测血清中TNF-α、IL-18炎性细胞因子水平。

2.5.2 肺组织含水量(湿重/干重)的测定 采血后开胸迅速取大鼠肺组织，用生理盐水洗去残血后分离出左右肺组织，右肺中叶用于测定肺组织含水量，将左肺大叶置于液氮罐中冻存待测MPO活性。方法：将切除的右肺中叶用滤纸吸干水后置于电子天平称湿重(W)，随后置于真空干燥箱内烘烤24 h后称干重(D)，采用W/D比值表示肺组织含水量。

2.6 统计学方法

应用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数加减标准差表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，两两均数间比较用SNK-q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠的一般状态

干预7天后，空白对照组和假手术组的大鼠精神状态良好，活动灵敏，毛发光泽，饮食正常，无明显鼻周分泌物，呼吸平稳，大便质软；模型组大鼠出现动作缓慢、饮食减少，毛发干枯凌乱、鼻周见大量分泌物、呼吸喘促、大便质干。针刺组大鼠轻度萎靡，缺乏活力，饮食较少，鼻周见较多分泌物；中药组大鼠状态尚可，行动、饮食增加，无明显毛发干枯、鼻周见少量分泌物；针刺结合中药组大鼠精神状态良好，活动、饮食明显增加，无毛发干枯，未见鼻周分泌物，呼吸平稳，大便质软。

3.2 各组大鼠TNF-α、IL-18水平比较

干预7天后，与空白对照组比较，假手术组TNF-α、IL-18水平差异无统计学意义(P>0.05)；模型组TNF-α、IL-18水平均明显升高(P<0.05)。与模型组比较，针刺组、中药组、针刺结合中药组TNF-α、IL-18水平均降低(P<0.05)，但都高于空白对照组(P<0.05)。与针刺组比较，中药组TNF-α、IL-18水平差异具有统计学意义(P<0.05)，针刺结合中药组差异显著(P<0.01)。与中药组比较，针刺结合中药组TNF-α、IL-18水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别例数(n)TNF-α(pg/mL)IL-18(pg/mL)空白对照组2076.86±8.7486.95±7.97假手术组2079.24±6.88∗85.03±5.91∗模型组19385.25±20.49#322.61±18.17#针刺组18258.99±9.37△219.86±5.41△中药组19227.71±6.99△□160.26±11.49△□针刺+中药组20182.13±12.53△□■121.36±6.79△□■

注：与空白组比较，*P>0.05，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与针刺组比较，□P<0.05；与中药组比较，■P<0.05。

3.3 各组大鼠肺组织含水量(湿重/干重)比较

干预7天后，与空白对照组比较，假手术组W/D比值差异无统计学意义(P>0.05)；模型组W/D比值显著升高(P<0.05)。与模型组比较，针刺组、中药组、针刺结合中药组W/D比值均降低(P<0.05)，尤其针刺结合中药组W/D比值显著降低(P<0.01)。与针刺组比较，中药组W/D比值差异具有统计学意义(P<0.05)，针刺结合中药组差异显著(P<0.01)。与中药组比较，针刺结合中药组W/D比值降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别例数(n)肺组织含水量(W/D)空白对照组201.37±0.08假手术组201.37±0.06∗模型组192.38±0.08#针刺组181.74±0.11△中药组191.59±0.05△□针刺+中药组201.38±0.06△□■

注：与空白组比较，*P>0.05，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与针刺组比较，□P<0.05；与中药组比较，■P<0.05。

4 讨论

目前SAP的发病机制尚不明确，Meisel等[12]提出了中枢神经系统损伤诱导的免疫抑制综合征(SIDS)，认为其可能是SAP发病的主要机制。脑卒中后发生的炎症反应能清除坏死细胞以及促进组织愈合，但炎症反应的过度能引起继发性损害，SIDS不但能抑制炎症反应，降低对脑组织的保护，还能降低机体对病原菌的抵抗力，进一步增加肺部感染的发生率[13]。TNF-α为一种多肽类细胞因子，由单核巨噬细胞分泌，在各种致炎因素的刺激或者机体处于应激状态下，TNF-α在炎症早期可大量释放，促进T细胞产生各种促炎因子，进一步加重炎症，从而对机体造成损伤[14]。IL-18是新近发现的具有多效能的炎症细胞因子，可作为前炎症因子诱导其他炎症介质的释放，促进T细胞增值及中性粒细胞的活化[15]。有研究证明[16]，IL-18能使白细胞在肺循环发生黏附聚集，引起TNF-α等炎性细胞因子释放，造成大鼠肺部炎症损伤并导致呼吸功能下降。

脑卒中早期易引起肺损伤，肺组织会出现肺泡结构变化、水肿及炎性浸润等典型病理特征[17]。本研究通过改良线栓法结合滴鼻法建立SAP模型，结果发现模型组大鼠肺组织出现肿胀、弥漫性充血、出血等符合肺组织损伤的表现，通过测定大鼠肺组织W/D值以及血清中的TNF-α、IL-18炎症因子水平，发现呈不同程度的升高，进一步表明肺组织出现炎性细胞浸润，由此认为SAP模型制备成功。在针刺、中药治疗后，结果显示，与模型组对比，各干预治疗组大鼠的一般状态均有一定的改善，其中W/D值、TNF-α、IL-18水平均呈现不同程度的降低，说明针刺以及中药干预可以有效减轻肺间质水肿和改善肺部炎症反应，从而促进肺功能的恢复。

SAP在中医学可归属于“咳嗽”“喘证”等范畴，其病理因素多为痰、虚，病因病机多为中风后机体阴阳失调，脾胃虚弱，气化不利，导致痰湿内生，易停留肺，使肺气不宣，而致咳嗽，且痰湿郁肺日久可化为痰火，痰热内扰，壅阻于肺，则出现咳嗽、痰黄质稠等症状，演变成痰热郁肺之证[18]，故治疗上采用清热化痰之法，且肺与大肠相表里，肺气不宣，则腑气不通，出现大便秘结；中风后多伴有肢体活动不利，日久则气虚血瘀，治疗上要兼顾行气活血通络、润肠通便。目前有研究证实[19]，苇茎汤合麻杏石甘汤能明显改善SAP痰热蕴肺证患者的炎症损伤、心肺功能，提高其免疫功能。本研究采用自拟方顽痰汤治疗SAP，此方由陈皮、姜半夏、老鹳草、桃仁、碧桃干、全瓜蒌、苦杏仁、佛耳草、生地、川芎、炙甘草组成，其中陈皮、姜半夏相互配伍共达健脾燥湿化痰之效；老鹳草祛风通络、活血化瘀；桃仁活血化瘀、止咳平喘，碧桃干、川芎与桃仁配伍加强活血止痛之效；全瓜蒌清热涤痰、润燥滑肠；苦杏仁与佛耳草配伍止咳平喘之效更佳；生地滋阴清热凉血；炙甘草补脾和胃、止咳平喘，诸药合用，共奏清热化痰、行气活血通络、润肠通便之效。此次结果显示，与模型组和针刺组比较，中药组W/D值、TNF-α、IL-18水平呈现不同程度的降低(P>0.05)，尤其针刺结合中药组降低显著(P<0.01)，说明顽痰汤能有效减轻肺组织炎症损伤。

针刺疗法以经络腧穴为理论依据，有疏通经络，调节气血，平衡阴阳之用。研究[20]证实，将肺俞、合谷、列缺作为主穴的针刺疗法治疗SAP有显著的临床效果。本研究选取大椎、列缺、尺泽、足三里、丰隆、太溪穴为针刺治疗穴位。大椎属督脉穴，解表泄热、通督行气；列缺为手太阴肺经的络穴，解表宣肺、通经活络；尺泽为肺经的合穴，清解肺热；足三里为足阳明胃经的合穴，调理气血、祛邪扶正；丰隆属足阳明胃经，为治痰要穴，加强祛痰之效；太溪为足少阴肾经的原穴，滋阴益肾，以上穴位相互配伍以达清热燥湿化痰、通经活络之效。此次结果显示，与模型组比较，针刺组的W/D值、TNF-α、IL-18水平均呈现不同程度的降低(P<0.05)，说明针刺治疗可以有效改善SAP大鼠的肺损伤。李侠等[21]研究发现，针刺结合泻肺化痰方对改善SAP患者的临床症状及促进神经功能康复有相对的优势。通过本研究发现，针刺结合中药组与其余各干预组比较差异显著(P<0.05)，说明针刺结合中药疗效优于单用针刺或中药治疗，能有效减轻SAP大鼠的肺组织炎症反应。

综上所述，针刺结合中药治疗卒中相关性肺炎大鼠有一定疗效，可以有效改善肺组织水肿、降低肺组织的TNF-α、IL-18炎性细胞因子水平，这可能为其减轻SAP肺组织损伤的机制之一，并且能为临床上治疗卒中相关性肺炎提供依据和优化方案。