活源方对CAG大鼠胃黏膜TLR4信号通路表达的影响

夏鹏飞，丁 念，梁 金，张觉人

(武汉市中医医院，湖北 武汉 430014)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis CAG)是一种消化系统常见病，是以胃黏膜及腺体萎缩为主要表现的胃部炎症反应。国内外流行病学研究表明，年龄、Hp感染、胆汁反流、生活、饮食习惯、精神等多种因素对CAG的发生有不同程度的影响。慢性萎缩性胃炎在中医学中属痞满、胃脘痛、嘈杂等范畴。关于这一疾病的表现在古籍中早有记载，如《灵枢·邪气脏腑病形》载：“胃病者，腹胀，胃脘当心而痛。”中医学认为，本病发病多与饮食不节、脾胃虚弱、劳倦太过、情志不畅以及先天禀赋等有关。CAG以腺体萎缩为主要表现，目前发病机制尚未明确。但CAG可经过长期慢性、多阶段演变过程逐渐进展为胃癌，因此，CAG被认为是(早期)胃癌前病变，对 CAG的早期预防以及治疗至关重要。随着时代的发展，物质充足、快节奏的生活方式，导致人们饮食、作息不规律，导致CAG患者越来越多。目前，西医对于CAG尚无根治方法，主要采用弱酸治疗、抗幽门螺杆菌等对症治疗，但因此病病程长、易反复、难治愈、易癌变，加之Hp逐渐增强的耐药性，故常规治疗具有一定的局限性[1]。有实验研究发现，胃复春片对胃黏膜再生有促进作用，能够使病变血液循环得到改善，有效消除炎症，提升血清胃泌素、胃动素水平，从而达到治疗目的[2]。本研究通过建立CAG大鼠模型，观察“活源方”对大鼠胃黏膜病理、血清TNF-α、IL-6含量及TLR4信号通路表达的影响，评估活源方治疗慢性萎缩性胃炎的疗效，为防治慢性萎缩性胃炎提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物及试剂 活源方颗粒剂组成：木香、砂仁、石斛、沙参、党参、白术、薏苡仁、佛手、麦芽、丹参、百花蛇舌草、莪术、甘草(按比例9∶9∶10∶30∶12∶9∶30∶10∶15∶10∶15∶5∶8配制，由武汉市中医医院制剂室提供)；胃复春(国药准字Z20040003，杭州胡庆余堂生产)；TNF-α、IL-6、TLR4的ELISA试剂盒(武汉英颢科技有限公司提供)。

1.1.2 实验动物 清洁级12周龄雄性CAG大鼠 120只，体重(200±10)g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(鄂)2017-0006，实验在武汉市中医药研究所国家中医药管理局中药制剂三级实验室进行。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 模型制作参照第二军医大学李兆申等[3]及中国中医科学院中医基础理论研究所陈小野[4]的方法改进，进行综合法造模，方法如下：所有大鼠均以0.2%的脱氧胆酸钠溶液灌胃，用量为1.5 mL/d，与脱氧胆酸钠溶液灌胃间隔5 h，再用50 ℃热水2 mL/d灌胃，并且加用饥饱失常(单日禁食禁水，双日给予足量食水)和劳倦过度(后4周起，将大鼠每日置于温水中游泳10 min)，连续造模12周后，随机抽取3只大鼠，麻醉后剖腹取胃，切片并在光镜下观察，确定大鼠造模成功。

1.2.2 造模成功标准 经病理确诊，慢性萎缩性胃炎的病理诊断标准符合《中药新药临床研究指导原则》(2002年版)：①固有腺体萎缩；②黏膜肌层增厚；③可有肠上皮化生或假幽门腺上化生；④固有膜炎症；⑤可有淋巴滤泡形成。

1.2.3 动物分组 空白对照组(不造模+生理盐水灌胃)；模型对照组(造模+生理盐水灌胃)；阳性对照组(造模+胃复春水溶液灌胃)；活源方低剂量组(造模+活源方低剂量灌胃)；活源方中剂量组(造模+活源方中剂量灌胃)；活源方高剂量组(造模+活源方高剂量灌胃)；每组20只。

1.2.4 给药方法 空白对照组不造模，每只大鼠灌服生理盐水2 mL/d；模型对照组造模后，每只大鼠灌服生理盐水2 mL/d；胃复春组造模后，每只大鼠灌服胃复春水溶液，剂量为144 mg/kg；活源方低、中、高组造模后，连续用活源方颗粒剂灌胃，分别给与6 mL/d、10 mL/d、14 mL/d给大鼠灌胃。30 d为1个疗程，共进行2个疗程，各组在第60天结束后禁食12 h，断头取血、取胃后，处死。

2 观察指标

2.1 一般状态

在实验期间，分别于造模成功后给药的第1天、第30天、第60天称量并记录各组大鼠体重。对各组大鼠的体重、毛色、精神状态、食欲、大便及活动情况进行观察。

2.1.1 胃黏膜组织学肉眼观察 给药第60天结束后禁食 12 h，大鼠断头取血，各组大鼠处死后，剖取全胃，沿胃大弯侧打开，生理盐水冲洗，平铺，观察胃体、胃黏膜皱襞形态改变、胃黏膜色泽，以及出血点情况及糜烂和溃疡情况。

2.1.2 肉眼及病理疗效评定 参考国家中医药管理局的《24个专业105个病种中医诊疗方案》：肉眼胃黏膜疗效评定：分别对肉眼下红斑、糜烂、出血、花斑、苍白、血管显露、黏膜结节等情况加以统计，计算各单个肉眼所见改善等级及总积分改善程度：①痊愈：胃黏膜恢复正常；②显效：胃黏膜病变积分减少2级以上；③有效：胃黏膜病变积分减少1级；④无效：胃黏膜病变无改变或加重。

2.1.3 血清中TNF-α、IL-6、TLR4含量 各组大鼠断头取血，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各项数据，按试剂盒说明书步骤操作。

2.2 统计分析

3 结果

3.1 一般状态

空白对照组体重基本无明显变化，毛色光泽、精神好、活泼好动、食欲佳、大便正常。模型组体重逐渐减轻，形体消瘦，毛色枯槁无光泽、精神萎靡、昏昏欲睡、食欲差、大便溏稀。胃复春组体重逐渐增加、毛色光泽、精神状态良好、食欲良好、大便正常。活源方组体重逐渐增加、毛色光泽、精神状态良好、食欲良好、大便正常。

3.2 胃黏膜组织学肉眼观察

空白组大鼠胃黏膜呈粉红色，皱襞整齐，厚度适中，未见明显出血点，弹性良好。模型组大鼠胃黏膜呈灰白色，皱襞低平紊乱，厚度变薄，可见散在出血点，弹性差。胃复春组及活源方各剂量组胃黏膜色泽、形态及弹性度均出现不同程度的好转，其中以活源方高剂量组改善最为明显。各组大鼠胃黏膜情况，见表1。

表1 各组大鼠胃黏膜组织学肉眼观察

3.3 肉眼及病理疗效评定

依据上述疗效评定标准，对阳性对照组，活源方低、中、高剂量组进行疗效评定，计算出总有效率。阳性对照组大鼠总数20只，其中治疗痊愈3例、显效10例、有效5例、无效2例，有效率90%。低剂量治疗组大鼠总数20只，治疗痊愈2例、显效8例、有效6例、无效4例，有效率80%；中剂量治疗组大鼠总数20只，治疗痊愈3例、显效11例、有效4例、无效2例，有效率90%；高剂量治疗组大鼠总数20只，治疗痊愈6例、显效11例、有效2例、无效1例，有效率95%。由此可见，治疗组病理组织学总有效率高于对照组(P<0.05)。

3.4 血清TNF-α、IL-6含量

各组大鼠血清TNF-α、IL-6含量指标变化情况，见表2。

组别TNF-αIL-6空白组14.08±0.5435.24±3.15模型组32.10±0.321)51.45±2.921)阳性对照组21.13±0.4143.58±3.12低剂量治疗组25.13±0.232,3)45.67±1.562,3)中剂量治疗组24.62±0.252,3)45.36±1.932,3)高剂量治疗组22.46±0.362,3)44.05±2.532,3)

注：与空白组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与阳性对照组比较，3)P>0.05。

结果表明，模型组与空白组血清TNF-α、IL-6含量有明显差异(P<0.05)；活源方各治疗组与模型组血清TNF-α、IL-6含量有明显差异(P<0.05)；活源方各治疗组与阳性对照组血清TNF-α、IL-6含量无明显差异(P>0.05)。

3.5 TLR4信号通路表达

各组大鼠胃黏膜组织TLR4比较，见表3。

组别TLR4空白组0.61±0.13模型组1.16±0.151)阳性对照组0.91±0.17低剂量治疗组1.04±0.122,3)中剂量治疗组0.95±0.232,3)高剂量治疗组0.89±0.162,3)

注：与空白组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与阳性对照组比较，3)P>0.05。

结果表明，模型组与空白组血清TLR4含量有明显差异(P<0.05)；活源方各治疗组与模型组血清TLR4含量有明显差异(P<0.05)；活源方各治疗组与阳性对照组血清TLR4含量无明显差异(P>0.05)。

4 讨论

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是人类免疫系统中重要的膜受体，目前被认为是哺乳动物细胞中唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递的跨膜蛋白[5]。TLRs可识别病原相关的外源性配体及某些内源性配体。在TLRs家族成员中，与CAG发生、发展关系最为密切的是TLR4。在受到配体刺激的情况下可传递炎症信号，并导致炎症细胞浸润及炎症因子释放[6]。血清IL-6、TNF-α是常用于评估胃黏膜损伤严重程度的促炎细胞因子，以上指标数值的变化对评估治疗慢性萎缩性胃炎的疗效具有重要参考意义。在实验中，模型组TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表达升高，与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05);活源方各治疗组与模型组比较，活源方各治疗组血清TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表达均有下降，差异有统计学意义(P<0.05)，表明大鼠胃黏膜受到损伤后，机体产生了一系列反应，给药治疗后，阳性对照组和活源方各治疗组均能纠正这些指标，表明活源方能调整机体出现的紊乱，修复损伤的胃黏膜，达到治疗慢性萎缩性胃炎的效果。

活源方由木香、砂仁、石斛、沙参、党参、白术、薏苡仁、佛手、麦芽、丹参、百花蛇舌草、莪术、甘草组成，各类中药相互作用、相辅相成，共同调理脾胃气机，改善脾胃功能。其中木香味辛、性温，归脾、大肠、三焦经，主行气、止痛、健脾消食，可促进胃肠蠕动、调整胃肠动力以镇痛[7]。砂仁味辛、性温，归脾、胃、肾经，主化湿开胃、温脾止泻、镇痛消炎，促进胃肠蠕动，同时可以抑制胃蛋白和胃溃疡中酶抑制导致的胃黏膜细胞障碍、急性胃黏膜损伤等胃溃疡症状[8]。石斛性味甘淡微咸，寒，归胃、肾、肺经，可益胃生津、滋阴清热。石斛能明显刺激脾淋巴细胞增殖，促进脾淋巴细胞中的白细胞介素-2及干扰素-γ的活性，具有抗炎、免疫作用[9]。沙参甘而微苦，有滋补作用。党参性甘，补中益气，和胃生津。党参中分离得出的菊糖型果聚糖CP-A对乙醇所致的急性胃溃疡模型大鼠3级胃黏膜损伤、高溃疡指数及胃黏膜出血损伤有显著改善作用[10]。白术、丹参有止痛之效，白术能调节胃肠道运动，调节肠道微生态，修复胃肠道黏膜损伤，并有抗炎等作用[11]。薏苡仁味甘、淡，性凉，利水渗透湿，健脾止泻。佛手有止痛和胃、燥湿化痰的功效，能增强体质、提高免疫机能[12]。麦芽行气消食，健脾开胃。百花蛇舌草、莪术有抗菌消炎、抗肿瘤作用。甘草味甘，性平，可补脾益气，调和诸药。

近年来大量的实验研究证实，长期服用中药汤剂，能改善胃黏膜病变，从而改善慢性萎缩性胃炎症状[13-15]。本研究中的活源方作为一个新型药方，可健脾和胃、调气养阴、化瘀解毒，药物配伍严谨、科学。本研究结果显示，经治疗后，活源方各治疗组血清TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表达均有下降，与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。表明活源方可促进胃黏膜损伤恢复，对治疗慢性萎缩性胃炎有良好的疗效。