利用CRISPR-Cas9技术实现拟南芥染色体易位（2020.5.29 iPlants）

2020年5月25日，Nature Plants杂志在线发表了来自德国卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）Holger Puchta课题组题为“RISPR–Cas9-mediated induction of heritable chromosomal translocations in Arabidopsis”的研究论文。

该研究首次在拟南芥中通过CRISPR-Cas9技术实现重组植物染色体的目的！

众所周知，CRISPR-Cas9系统可定向诱导特定位点的双链断裂（DSBs），并可用于基础研究以及农业性状的产生和改善。而在包括植物在内的多细胞真核生物中，DSB的修复主要通过两种途径介导，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组。通过NHEJ连接无关的断裂末端，一次诱导多个DSB会可以实现染色体的重排。此外，在异源染色体上同时诱导两个DSB可能导致相互易位的形成。

该研究通过SaCas9-Cas9系统在拟南芥的1号染色体（Chr1）和Chr2上诱导了两个DSB（TL1-2），其目标位点被设计为在基因间区域，距离Chr1和Chr2的长染色体臂末端0.5Mbp（见下图a）。并对易位频率进行定量测量，结果显示在TL1-2的两个连接处检测到大约0.01%的易位频率，表明通过使用CRISPR-Cas9确实可以实现相互的染色体臂交换。此外，该研究还表明连接位点没有核苷酸丢失，说明是经典NHEJ途径负责染色体易位形成。但是在确实经典NHEJ途径突变体中，易位频率的效率反而提高了约五倍，但是连接处有核苷酸的缺失和插入（如下图）。

此后，該研究通过农杆菌介导卵细胞（EC）特异性启动子表达SaCas9的转化，然后选择初级转化阳性苗。通过在T1植物的卵细胞中诱导了易位事件，并筛选了各自植物的后代中新形成的交界处。然后通过基于PCR的筛选检查阳性池中的单个植物的重组体。然后繁殖携带相互易位的植物，并在下一代中鉴定出易位纯合的植物（见下图）。……