基于CRISPR/Cas9构建小鼠UOX基因敲除模型

张茹君 夏海林 朱赟 黄晶 孟雨菡

[摘要] 目的 通过 CRISPR/Cas9获得UOX基因敲除的小鼠纯合品系，为建立高尿酸血小鼠动物模型奠定基础。方法根据小鼠 UOX 基因第三外显子前后两个位点设计双sgRNA，通过PCR、体外转录和纯化获得sgRNA和Cas9 mRNA。将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射进小鼠原核胚后，体外培养至二细胞胚阶段，进行胚胎移植至代孕母鼠。F0代小鼠出生后，提取其DNA进行电泳分析和测序分析。F0代交配繁殖至F2代获得UOX缺失的小鼠纯合品系。 结果 显微注射sgRNA和Cas mRNA至原核胚，成功获得50枚囊胚。移植后生育17只幼鼠。其中，有 8只小鼠UOX基因缺失突变，突变率为47.06 %。成功构建了UOX缺失的小鼠纯合品系。 结论 利用 CRISPR/Cas9，成功获得 UOX缺失的小鼠胚胎和纯合品系，为CRISPR/Cas9获得高尿酸血的小鼠动物模型奠定基础。

[關键词] CRISPR/Cas9;UOX;基因编辑;高尿酸;动物模型

[中图分类号] R4          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2020）03（a）-0032-04

Construction of Mouse UOX Gene Knockout Model Based on CRISPR / Cas9

ZHANG Ru-jun1， XIA Hai-lin1， ZHU Yun2， HUANG Jing3， MENG Yu-han2

1.Changzhou Cavens Experimental Animal Co.， Ltd.， Changzhou， Jiangsu Province， 213104 China;2.Jiangsu Kebiao Medical Testing Co.， Ltd.， Changzhou，Jiangsu Province， 213461 China;3.Baige Gene Technology （Jiangsu） Co.， Ltd.，Chang zhou， Jiangsu Province， 213000 China

[Abstract] Objective To obtain homozygous strains of UOX knockout mice by CRISPR / Cas9， and to lay the foundation for establishing an animal model of hyperuricemia mice. Methods Double sgRNA was designed based on two sites before and after the third exon of mouse UOX gene， and sgRNA and Cas9 mRNA were obtained by PCR， in vitro transcription and purification. After microinjection of sgRNA and Cas9 mRNA into mouse prokaryotic embryos， they were cultured in vitro to the two-cell embryo stage， and embryos were transferred to surrogate mother rats. After F0 mice were born， their DNA was extracted for electrophoretic analysis and sequencing analysis. FOX generations were bred to F2 generations to obtain UOX-deficient mouse homozygous lines. Results Microinjection of sgRNA and Cas mRNA into prokaryotic embryos successfully obtained 50 blastocysts. After transplantation， 17 young rats were born. Among them， 8 mice had UOX gene deletion mutations， and the mutation rate was 47.06%. A homozygous mouse line lacking UOX was successfully constructed. Conclusion UCRISPR-deficient mouse embryos and homozygous strains were successfully obtained using CRISPR / Cas9， laying a foundation for CRISPR / Cas9 to obtain hyperuricemia mouse animal models.

[Key words] CRISPR / Cas9; UOX; Gene editing; Hyperuricemia; Animal model

高尿酸血症（hyperuricemia）是由嘌呤代谢紊乱，尿酸排泄障碍引起的血尿酸异常为临床表现的异质性疾病。尿酸病理性升高有5%～12%的风险导致尿酸结晶累积并损伤关节[1]，引起痛风、急性及慢性关节炎等。并且，高尿酸血症易引发并发症，如高血压、高血脂、2型糖尿病、冠心病。临床上常规的高尿酸血症及痛风治疗手段为口服降尿酸药物[2]，目前尚未有根治痛风的药物，新型降尿酸药物开发需要利用高尿酸动物模型进行降尿酸药物药效及药理筛选。故建立稳定性好，更接近患者发病特征的高尿酸动物模型，能提高新型降尿酸药物开发效率及成药性，优化痛风治疗格局。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术凭借其简便性、特异性和高效性，在疾病动物模型构建领域应用日趋广泛和深入。该研究利用CRISPR/Cas9，敲除小鼠基因组内尿酸氧化酶（Urate Oxidase，UOX）基因，以诱导小鼠尿酸分解障碍，为建立高尿酸血小鼠动物模型奠定基础，现报道如下。

1  材料与设备

1.1  实验动物及饲料

实验动物为野生型C57BL/6健康雌鼠（SPF 级，3～4周龄）;野生型雄性C57BL/6健康小鼠（SPF 级，6～8 周龄，体重 30 ～ 35 g），均来自并饲养于常州卡文斯实验动物有限公司【SCXK（苏）2016-0010】。饲养环境 SPF 级环境，12 h 交替昼夜，温度（22±4）℃，湿度（55±10）%。适应饲养时间1周。试验方案通过实验动物伦理学审查。

1.2  实验试剂

px330-Cas9、px330-sgRNA来自Addgene公司。QIAQuick PCR purification kit来自Qiagen公司。TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit來自Thermo公司（型号：K0441）。TA Cloning kit 来自Invitrogen。水（Nuclease-free）、MEGAshortscript T7 kit、mMESSAG EmMACHINE T7 kit和MEGAclear kit来自Life Technologies公司。β-巯基乙醇、DMSO 、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）。

1.3  实验仪器

倒置显微镜（Olympus，型号：IX73号）;显微操作装置（Narishige，型号：MMO-202ND）;电压冲击驱动系统（Primer Tech，型号：PMM-150FU）;二氧化碳培养箱（Thermo，型号：BB15）;SZX7立体显微镜（Olympus，型号：SZX7）。

2  方法

2.1  引物设计

在Uox基因（NCBI Gene ID ：22262）第三号外显子功能域的前部和后部分别设计两条sgRNA，根据sgRNA结构设计PCR上游引物 Uox-sgRNA-1、Uox-sgRNA-2，下游引物T7SG-R0。引物序列见表1。

2.2  制备sgRNA转录模板

分别按表2混合以下试剂，进行两次PCR扩增sgRNA模板。反应条件均为98 ℃预变性 5 min;按循环程序（98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）进行35个循环;72 ℃延伸 5 min。反应产物取 50 μL 进行 2 %琼脂糖凝胶电泳，判断PCR 结果。回收DNA。

2.3  sgRNA的体外转录

按表3混合sgRNA体外转录反应体系。混匀后，37℃孵育2 h。加DNase 1 μL，37℃孵育15 min;纯化，分装，-80℃保存。

2.4  Cas9 mRNA的体外转录

按表4混合Cas9 mRNA PCR反应体系。正向引物序列为5`-TTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3`，反向引物序列为5`-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3`。混匀后，反应条件同2.2，反应产物取 50 μL 进行 2 %琼脂糖凝胶电泳，判断PCR结果。回收DNA。

用QIAQuick PCR purification kit纯化胶内Cas9 PCR产物，用mMESSAGEmMACHINE T7 kit试剂盒体外转录Cas9 mRNA。用MEGAclear kit纯化Cas9 mRNA。

2.5  UOX突变小鼠胚胎的获得

向若干只雌性C57BL/6小鼠注射5 IU PMSG，48 h后注射10 IU hCG，与雄性C57BL/6小鼠合笼一夜。hCG注射后约20 h，对见栓雌鼠实施安乐死收集卵丘细胞复合体。

将卵丘细胞复合体移入M2+透明质酸酶培养基中洗涤数次，胚胎置于37℃的KSOM培养基（用矿物油覆盖）5%CO2培养。在显微镜下用显微注射针向原核胚内注射Cas9 mRNA（100 ng/μL）和UOX-sgRNA（50 ng/μL），继续培养胚胎24 h至两细胞胚。

2.6  胚胎移植

结扎雄鼠与发情的C57BL/6雌鼠合笼，次日选择见栓0.5 d的雌鼠作为代孕母鼠。在体视显微镜下，从代孕母鼠背部找到输卵管，将胚胎移从输卵管移植入子宫。代孕母鼠手术缝合，放入培养间培养观察。

2.7  UOX—小鼠鉴定

代孕母鼠3周后生产F0代小鼠。出生后3周雄性和雌性F0代小鼠分开饲养。取出生后3周F0代小鼠尾尖血，用DNeasy blood and tissue kit 提取基因组DNA，PCR验证基因敲除情况，验证序列见表5，PCR扩增体系见表6。PCR反应条件为95 ℃预变性 5 min;按循环程序（ 95℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 40 s）进行30个循环;68 ℃延伸 5 min。用QIAQuick PCR purification kit 纯化PCR产物，用TA Cloning kit 克隆，反应产物测序。

2.8  UOX—小鼠纯合品系构建

将 F0 代的基因敲除小鼠与野生型小鼠交配获得后代F1，对F1 代小鼠进行突变分析。选择突变的 F1 代杂合雌鼠和雄鼠交配获得后代F2，对F2 代小鼠进行突变分析。对F2代中纯合小鼠进行交配，以构建UOX—小鼠品系

3  结果

3.1  F0代小鼠的获得

该研究两细胞胚率为81.7%（58/71），显微注射了Cas9 蛋白和UOX-sgRNA的胚胎移植至58个两细胞胚。将50个囊胚移植到2只代孕母鼠子宫，2只均怀孕，共生产17 只小鼠，出生率为34.0%（17/50）。F0代小鼠外观正常，健康状态良好，均无外伤或感染发生。

3.2  UOX—小鼠鉴定结果

sgRNA转录模板经扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带消失（图1），F0代小鼠鼠尾DNA测序结果显示，其中8只小鼠的 UOX基因被敲除，突变率为47.06%。突变小鼠的测序图见图2。8只UOX—小鼠与未突变小鼠外观无差异。

4  讨论

高尿酸血症约80%源于内源性尿酸代谢紊乱[3]。高尿酸血症患者体内嘌呤单钠尿酸盐（purine monosodium urate，MSU）在关节异常累积，会引起痛风。痛风严重影响患者生存质量，会导致痛风石沉积、关节炎反复发作和关节畸变[4]。据报道，中国成年人群痛风的校正患病率达 8.4%[5]。2017年中国痛风患者从2009年的9000万人增长至2017年的1.8亿人。并且，痛风可加重肾脏病变，增加高脂血症、高血压病的发病率[6-7]。故痛风严重影响中国社会发展，研究高尿酸血症和痛风的治疗药物及其药物筛选的动物模型，具有显著的临床意义及社会价值。

利用基因组靶向编辑技术制备动物模型是当今研究的热点及前沿领域。CRISPR/Cas9系统具有定位靶向基因组的高效率，转染多个sgRNA的高成功率的优势，成为广泛使用的基因编辑技术之一，已应用于构建各种疾病的动物模型，如神经退行性疾病[9]，肿瘤[10]等。CRISPR-Cas系统源于大肠杆菌获得性免疫系统，主要部件为RNA引导的有规则间隔的短回文重复序列sgRNA[11]。通过sgRNA序列，能将Cas9酶切蛋白引导至目的基因特定位点使之DNA 双链断裂（double-strand breaks，DSB）。非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）参与修复DSB，产生突变等位基因。CRISPR/Cas9系统可实现基因敲入、重排、激活、抑制、重组和敲除，具有高效、专一和成熟等优点。故该研究采用CRISPR/Cas9敲除小鼠体内的UOX基因，以构建高尿酸血动物模型。

UOX作为目的基因的考量在于，UOX基因能表达活化态UOX蛋白，使小鼠体内尿酸在UOX催化下分解为尿囊素，最终形成尿囊酸排泄。若成功基因敲除小鼠UOX基因，有望使尿酸潴留形成高尿酸模型[12]。人体内UOX基因在进化过程中突变沉默，尿酸无法继续分解，成为嘌呤核苷酸代谢终末产物直接排泄[13]。故采用基因敲除小鼠UOX基因的方式改造高尿酸模型，与直接注入诱导剂至动物体内构建的高尿酸模型相比，更真实复制人嘌呤代谢紊乱引起的高尿酸血症及痛风机制。

该研究在小鼠UOX基因第三个外显子功能域上设计拼接了sgRNA。注射受精卵是获得CRISPR/Cas9改造动物模型最快的途径[14]，故该研究将体外转录后的sgRNA和Cas注射到原核胚中。基因编辑后的原核胚体外培养为二细胞胚，再通过手术将胚移植到代孕母鼠的子宫内孕育。3周后，17只F0代小鼠出生，经提取DNA扩增后电泳分析和测序分析，其中8只小鼠确定为UOX-突变小鼠，突变率为47.06%，其中一只小鼠为疑似突变。并且，该研究成功繁育成功建立了UOX-突变小鼠纯合种群，形成了稳定的UOX敲除小鼠模型。突变小鼠与正常小鼠外观和精神状态一致，无感染或外伤发生。Hosoyamada M等人[12] 双敲除小鼠Urat1-Uox基因构建肾性低血糖症动物模型，发现Urat1-Uox-DKO小鼠中尿酸盐的尿排泄量比人类高约25倍，印证了该文敲除小鼠UOX基因可用于构建高尿酸模型。

综上所述，该研究首次采用敲除小鼠UOX基因构建高尿酸模型，能获得稳定、健康的UOX敲除小鼠品系，为高尿酸动物模型的建立提供了新的思路及方法。该研究进一步挖掘UOX基因的作用及改造方法，为其科研或临床应用提供依据。

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（收稿日期：2019-12-05）