溪黄草中迷迭香酸的含量测定研究

王清，曹雨诞，陈佩东

作者单位：1江苏省中医院药剂科，江苏 南京210029；

2南京中医药大学药学院，江苏 南京210046

溪黄草饮片为多年生草本植物唇形科香茶菜属Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara的地上部分，在华东及西南各省均有分布［1］。《揭阳县民间常用草药简编》记载溪黄草性凉、味甘苦，具有保肝利胆、清热退黄等功效，临床上用于治疗急性胆囊炎、急性黄疸型肝炎以及食道炎等疾病［2］。近年来的研究表明，溪黄草提取物对由四氯化碳诱导的肝纤维化有保护作用［3］，并可影响肝癌HepG2细胞基因的表达［4］。溪黄草中化学成分类型主要有酚类、二萜类、三萜类、黄酮类、氨基酸以及木脂素类等［5-6］。溪黄草在临床中较为常用，在江苏、浙江、四川、湖南等省的中药饮片炮制规范中都收载有溪黄草饮片。近年来，溪黄草的化学成分及质量标准控制研究有一定的进展，对溪黄草中的二萜类、酚酸类等成分进行了定性及定量分析研究［7-9］。为进一步研究溪黄草中主要化学成分，本研究于2016年1月至2018年6月应用高效液相色谱-质谱法（HPLCMS）对溪黄草中化学成分进行了定性分析，并对其中的迷迭香酸进行了含量测定，为溪黄草的质量控制提供了科学依据。

1 材料

1.1仪器高效液相色谱（HPLC）分析采用Waters 2695色谱仪（美国Waters公司），液质联用采用AB SCIEX Triple TOFTM5600系统进行分析（美国AB公司），配备岛津LC-20A快速液相系统（LC-20 ADXR泵及SIL20AXR自动进样器，日本岛津公司），色谱柱为Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。FA1104N型分析天平。

1.2试剂溪黄草饮片采购于安徽益生源中药饮片科技有限公司（生产批号160113），安徽普仁中药饮片有限公司（生产批号A151101，160101），亳州市京皖中药饮片厂（生产批号151203）。经南京中医药大学中药鉴定教研室刘圣金副教授鉴定为唇形科植物溪黄草Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara。对照品：迷迭香酸（生产批号MUST-15082904）及槲皮素（生产批号MUST-15090717）购于成都曼斯特科技有限公司，咖啡酸（生产批号110885-200102）购于中国中药药品生物制品检定所，芦丁（生产批号YN1103SA14）购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1溪黄草中化学成分定性分析

2.1.1供试品及混合对照品溶液的制备 取溪黄草饮片粉末过四号筛（250 μm，65目），称取约1 g，以95%乙醇25 mL水浴回流1 h，放冷后过滤并取续滤液，即得供试品溶液。精密称取迷迭香酸0.93 mg，槲皮素0.52 mg及咖啡酸0.48 mg对照品置于5 mL容量瓶中，分别加甲醇定容。取芦丁2.50 mg置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇定容。分别吸取上述溶液100 μL制成混合对照品溶液。

2.1.2色谱条件及质谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC C181.7 μm（2.1×100 mm）；流动相：A为0.2%甲酸，B为甲醇，梯度洗脱。0 min，92A；0～1 min：92～88 A；1～2 min，88～82A；2～3 min，82～77 A；3～6 min，77～50 A；6～14 min，50～30 A；14～18 min，30～10 A；18～19 min，10～92 A；19～20 min，92 A。流速为0.2 mL/min，柱温设置为30℃，检测波长254 nm，进样量5 μL。质谱条件设定为电喷雾离子源，以负离子模式扫描。干燥气温度设置为550℃，干燥气流量为10 L/min，离子源温度设置为550℃，雾化气电压为40 psi（1 psi＝6.895×103Pa），毛细管电压为 4 500 V。对照品HPLC-MS图见图1A，样品HPLC-MS图见图1B，分析结果见表1。

2.2溪黄草中迷迭香酸的含量测定

2.2.1色谱条件色谱柱为Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈和0.1%磷酸（25∶75），检测波设定为330 nm，流速为1 mL/min，柱温设定为30℃，进样量为20 μL。

2.2.2溶液制备

2.2.2.1对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸50.60 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释置刻度，摇匀，配置成浓度为5.06 mg/mL的溶液，即得。

图1 溪黄草高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）及HPLC色谱图：A为混合对照溶液总离子流图，B为溪黄草饮片总离子流图，C为迷迭香酸对照溶液HPLC色谱图，D为供试品溶液HPLC色谱图

表1 溪黄草中的化学成分分析结果

2.2.2.2供试品溶液的制备 取溪黄草饮片粉末约1 g，精密称定后置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%乙醇，称定质量，水浴回流1 h，放冷后以50%乙醇补足质量。精密吸取续滤液1 mL至10 mL容量瓶中，以50%乙醇定容至刻度，即得（HPLC色谱图见图1C，1D）。

2.2.3系统适用性试验 分别取供试品及对照品溶液，按色谱条件进行测定。实验结果表明供试品与对照品溶液在相同的位置出峰，且未见与其它组分相互干扰。色谱图见图1C，1D。取供试品溶液，按色谱条件进样，迷迭香酸理论板数按色谱峰计不低于3 000。

2.2.4线性关系考察 精密量取1 mL迷迭香酸对照品溶液置10 mL量瓶中，以甲醇定溶，作为母液。精密量取1 mL母液置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。依次按上述操作，得到一定浓度的稀释溶液。分别吸取上述溶液20 μL，按2.2.1中色谱条件，测定迷迭香酸峰面积，再以峰面积对其相应的进样量进行回归，得到线性方程Y＝65 718 018.83X-3 868.35，r＝0.999 7，迷迭香酸在0.063～1.012 μg范围内呈良好的线性关系，检测限为0.437 1 μg/mL，定量限为0.131 9 μg。

2.2.5精密度试验 取同一供试品溶液，按照上述色谱条件连续测定6次，计算迷迭香酸的峰面积，结果迷迭香酸的相对标准偏差（RSD）为1.32%，表明仪器精密度良好。

2.2.6重复性试验 取同一批样品，按照上述供试品溶液的制备方法制备溪黄草供试品溶液，进样，重复测定6次，计算迷迭香酸的峰面积，结果迷迭香酸平均含量为0.028 5%，RSD为2.98%，测定结果重复性较好。

2.2.7稳定性试验 在室温条件下，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12、24 h测定同一样品溶液，计算迷迭香酸的峰面积，结果迷迭香酸峰面积RSD为0.39%，表明迷迭香酸24 h内稳定性较好。

2.2.8加样回收率试验 精密称取6份已知含量的同一批样品0.5 g，按照上述供试品溶液的制备方法，然后加入一定量的对照品溶液，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样，测定各成分的回收率，测定结果见表2。

2.2.9样品含量测定 精密称取各批次样品，按上述供试品溶液的制备方法及色谱条件测定，每批样品平行测定2次，计算溪黄草饮片中迷迭香酸的含量，结果见表3。

表2 迷迭香酸加样回收率结果

表3 迷迭香酸含量高效液相色谱法测定结果

3 讨论

香茶菜属植物基源植物较多，常易混淆［10］。其中常见化合物有酚酸类［11］、黄酮类及萜类物质［12-13］，结合以往文献，本研究以芦丁、槲皮素、咖啡酸及迷迭香酸为对照溶液对溪黄草进行了HPLC-MS分析。根据负离子模式下分子离子及碎片离子峰，对照文献［14］，鉴定了其中7个化合物。综合考虑实验结果后选用迷迭香酸进行含量测定。

迷迭香酸可对小鼠急性肝损伤有保护作用［15］，有助于改善与胆汁淤积相关的肝损伤［16］，而且具有抗炎［17］、神经保护［18］等作用，与溪黄草的功效相吻合。同时，迷迭香酸是中药饮片及其复方制剂常用的检测指标成分［19］。本研究分别考察了30%、50%、70%及95%的乙醇提取；水浴和超声提取；30、45、60、75、90 min的提取时间；最终确定以50%乙醇作为溶剂，90℃水浴提取30 min。实验结果表明，各批次溪黄草中迷迭香酸含量在0.028%～0.035%之间，重现性较好，为溪黄草饮片质量控制提供了依据。