一株对稻瘟病菌有抗菌活性的特基拉芽孢杆菌WRN032的筛选及发酵条件优化

孙 露，单潇潇，蒋建兰*，张桂山

1天津大学化工学院 系统生物工程教育部重点实验室，天津 300350；2中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京100081

水稻是当今世界最重要的粮食作物之一[1,2]，而稻瘟病是对水稻危害最严重的真菌病害之一[3]。近年来，利用细菌拮抗植物病原真菌以防治植物病害的生物防治手段正逐步受到人们的关注[4-6]，研究发现，芽孢杆菌能够产生多种防治动植物病原体的代谢产物[7,8]，具有丰富的医学应用价值。据报道，特基拉芽胞杆菌具有抗菌、促生等作用[9,10]，可用于抗菌药物，而针对细菌中抗菌活性物质的发酵优化也已成为研究热点[11-13]。

目前细菌发酵条件的优化多采用单因素试验结合正交设计[14]或响应面设计[15]。相对于正交设计，响应面设计考虑了随机误差，能够对各个水平进行分析，得到一定试验范围内的最优方案，具有操作简洁、模型选择性广、预测精度较高的特点。综合文献报道，选取在单因素试验基础上，利用响应面设计中的多因素显著性筛选试验(Plackett-Burman design，PBD)筛选出对抑菌活性有显著影响的3个因素，再运用中心复合设计(central composite design，CCD)进行试验，确定重要因素的最优条件。

本研究以不同的芽孢杆菌为来源菌、不同的植物病原真菌为靶标菌进行牛津杯法抑菌试验，筛选出对稻瘟病菌的生长有良好抑制效果的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)WRN032菌株，然后对该菌株的发酵条件进行优化，以期得到最佳优化条件。

1 仪器与试剂

1.1 供试菌株

10种芽孢杆菌(见表1)由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所分离保存，10种真菌(见表1)由中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China，ACCC)进行保藏。

1.2 试剂

Landy培养基(用于芽孢杆菌的发酵培养)：MgSO4·7H2O 0.500 g/L、KH2PO41.000 g/L、KCl 0.200 g/L、MnSO4·H2O 0.010 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、CuSO4·5H2O 0.002 g/L、yeast extract 1.000 g/L、L-phenylalanine 0.020 g/L、L-glutamic acid 5.000 g/L、(NH4)2SO42.000 g/L、柠檬酸钠0.010 g/L、蒸馏水950 mL、1%葡萄糖溶液50 mL。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)用于稻瘟病菌的培养，购自Coolaber公司； 二甲基亚砜(DMSO AR)、乙酸乙酯(AR)、石油醚(AR)和正丁醇(AR)购自天津市江天化工技术有限公司。

1.3 仪器

UV6000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；ZWY-211B卧式恒温摇床(上海智城有限责任公司)；ME204、ME802电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；MJB1-B001-Q3灭菌器(无锡益腾压力容器有限公司)；LRH-70恒温生化培养箱、DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；3K15台式冷冻离心机(SIGMA公司)。

2 方法

2.1 菌株筛选

2.1.1 菌种活化

芽孢杆菌活化：取保存于-80 ℃冰箱甘油保藏管中的10种芽孢杆菌(见表1)菌液，分别划线纯化后于37 ℃条件下培养24 h，置于4 ℃冰箱中保存备用。

真菌活化：将保存于斜面培养基的10种真菌(见表1)接于PDA上，30 ℃恒温培养。

表1 菌株名称和编号Table 1 Name and number of the strain

2.1.2 种子液制备

用250 mL锥形瓶装入95 mL的Landy培养基，灭菌，加入1%的葡萄糖溶液5 mL，然后分别加入一环活化后的芽孢杆菌菌株，于37 ℃、180 rpm条件下培养18 h，即得种子液。

2.1.3 摇瓶发酵

用250 mL锥形瓶装入95 mL、初始pH为5.5的Landy培养基，灭菌，加入1%的葡萄糖溶液5 mL，然后分别加入1 mL芽孢杆菌菌株的种子液，于37 ℃、180 rpm条件下培养24 h，即得发酵液。

2.1.4 样品前处理

取不同芽孢杆菌发酵液各1 L，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇按照极性从小到大的顺序对发酵液进行萃取，每种有机溶剂均萃取三次，合并同种萃取液后得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液。

将不同芽孢杆菌发酵液的有机溶剂萃取液分别使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，然后利用真空干燥箱进行干燥，最终得到30种干燥物，置于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中密封避光保存。

2.1.5 牛津杯法抑菌试验

取等量30种干燥物分别溶于DMSO，加入蒸馏水稀释至药液浓度1 mg/mL。在PDA平面上均匀摆放三个牛津杯，进行三组试验，每组试验平行三次。试验组：向牛津杯中滴加100 μL 1 mg/mL药液；空白对照：滴加等体积DMSO溶液；阴性对照：滴加等体积蒸馏水。在PDA中央位置接种真菌，30 ℃恒温培养7～15天，观察并筛选出对一种或多种真菌具有抑菌效果的干燥物，测定其抑菌圈直径。试验筛选得到特基拉芽孢杆菌WRN032发酵液的乙酸乙酯萃取干燥物对稻瘟病菌的抑菌效果最好(见图1)，该菌株从香菇菌糠中培养分离获得，菌种保藏编号为CGMCC 14405，用特基拉芽孢杆菌WRN032进行后续试验。

图1 特基拉芽孢杆菌WRN032对稻瘟病菌的抑菌效果及空白对照Fig.1 Bacteriostatic effect of B.tequilensis WRN032 on M.oryzae and blank control

2.2 发酵条件优化

2.2.1 单因素试验

参考相关文献与研究经验，在Landy培养基成分固定前提下，测定275 nm波长处的吸光度OD及抑菌圈直径d为考察指标，采用控制变量法分别考察初始pH(A)、接种量(B)、摇床转速(C)、培养温度(D)、培养时间(E)、葡萄糖浓度(F)和摇瓶装液量(G)对特基拉芽孢杆菌WRN032发酵的影响，试验因素和水平见表2。

2.2.2 PBD试验设计

根据单因素试验结果，在各影响因素趋势图(见图2)中对两种指标均呈上升趋势的区间内，选择最高值和最低值作为PBD试验设计中各因素高、低水平，设计进行PBD试验，继续后续优化。PBD试验因素和水平见表3。

表2 单因素试验因素和水平Table 2 The factor levels of single-factor test

2.2.3 CCD试验设计

根据单因素和PBD试验结果(见表4)，筛选出影响显著的因素，并确定其他影响因素的最佳水平。利用Design-expert软件设计进行CCD试验，试验设计和结果见表5。

2.2.4 验证试验设计

采用初始发酵和优化发酵条件分别对特基拉芽孢杆菌WRN032菌株进行发酵，并进行样品前处理和牛津杯法抑菌试验，测定并对比两种发酵条件下的吸光度OD和抑菌圈直径d。

3 结果

3.1 单因素试验结果

根据图2可知七种因素的趋势情况，分别在两指标共同上升区间内选择高、低水平进行后续PBD试验。以培养温度为例进行详细说明：温度在26～37 ℃范围内，OD和d随温度的升高呈先升高后降低的趋势，且当温度在30 ℃左右时，两种指标均最大，然后逐渐降低，温度的3、4水平分别为30和34 ℃，二者温差过大而指标降低幅度并不大，为避免出现误差，因此在后续PBD试验中，选择培养温度高、低水平为32和26 ℃。最终确定各因素高、低水平分别为：初始pH 7.0和6.0；接种量3和1 mL；摇床转速220和140 rpm；培养温度32和26 ℃；培养时间72和24 h；葡萄糖浓度5%和1%；摇瓶装液量125和50 mL。其中，初始pH的低水平未选择5.5是由于在较低pH下Landy培养基灭菌后呈现浑浊状态，会影响菌株生长以及OD的测定。

图2 不同因素五水平对吸光度和抑菌圈直径的影响Fig.2 The influence of five levels of different factors on OD and d

3.2 PBD试验结果

依据表3和表4分析可得：七种影响因素对特基拉芽孢杆菌WRN032发酵液吸光度OD的影响顺序为：培养时间>培养温度>初始pH>摇床转速>摇瓶装液量>接种量>葡萄糖浓度；对其抑菌圈直径d的影响顺序为：培养时间>初始pH >培养温度>摇床转速>摇瓶装液量>接种量>葡萄糖浓度。P<0.05为显著性影响因素，取各因素交集并综合单指标进行分析，得到培养时间、培养温度和初始pH为显著性影响因素，在确定另外四种因素的最佳水平，即摇床转速220 rpm，摇瓶装液量100 mL/250 mL(即40%)，接种量1 mL/100 mL(即1%)，葡萄糖浓度0.4 g/mL溶液 5 mL/100 mL(即2%)基础上，选择初始pH(X1)、培养时间(X2)和培养温度(X3)三因素进行后续CCD试验。

表3 PBD试验设计及结果Table 3 Design and results of PBD test

表4 PBD试验结果分析Table 4 Result analysis on PBD test

3.3 CCD试验结果

根据表5和表6分析可知：进行回归分析后拟合可得OD和d的最适模型为二次多项式函数，两模型P值分别为< 0.000 1和0.004 0，均小于0.05(显著)，失拟值分别为0.079 2和0.950 7，均大于0.05(不显著)，表明OD和d的真实值与预测值之间拟合度较好，且随机误差对试验结果的影响较小，可用此模型来预测两种指标的实际情况。

表5 CCD试验设计及结果Table 5 Design and results of CCD test

表6 方差分析结果及R2Table 6 ANOVA results and R2

图3 三种显著影响因素对吸光度和抑菌圈直径的交叉影响等高线图Fig.3 Cross-effect contour map of three significant influencing factors on OD and d

根据图3可知，图a1、b1、c1的考察指标为OD，图a2、b2、c2的考察指标为d。图中中心深色圆圈处表示两种指标达到最优，即OD≥0.52，d≥19 mm。综合考虑各因素影响，最终确定特基拉芽孢杆菌WRN032的最佳发酵条件为：接种量1%，摇瓶装液量40%，葡萄糖浓度2%，摇床转速220 rpm，初始pH6.5，培养时间48 h，培养温度30 ℃。

3.4 验证试验结果

图4为初始发酵条件和优化发酵条件分别为：接种量1%和1%，摇瓶装液量40%和40%，葡萄糖浓度1%和2%，摇床转速180和220 rpm，初始pH 5.5和6.5，培养时间24和48 h，培养温度37和30 ℃，对OD和d两指标的验证对比图。优化条件下OD为0.536，抑菌圈直径d为22.31 mm，较初始发酵条件的OD为0.187，抑菌圈直径d为8.78 mm，分别增长了186.63%和154.10%，增长幅度明显，优化后的抗菌活性较优化前有明显提高。

图4 初始发酵与优化发酵对两种指标的验证对比图Fig.4 Verification and comparison of two indicators for initial fermentation and optimized fermentation

5 讨论

本研究通过牛津杯法抑菌试验筛选得到特基拉芽孢杆菌WRN032菌株对稻瘟病菌有较好的抗菌活性，然后利用单因素试验、PBD设计试验和CCD设计试验对该菌株的发酵条件进行了优化，优化结果显示与初始发酵条件相比，在最优发酵条件下，特基拉芽孢杆菌WRN032菌株的发酵液吸光度OD提高了186.63%，抑菌圈直径d增大了154.10%，优化效果明显，说明采用单因素试验结合响应面设计能够有效提高该菌株发酵液的抗菌活性。

经验证，在试验范围，此发酵条件下，特基拉芽孢杆菌WRN032发酵液的吸光度和有机溶剂萃取物的抑菌圈直径均为最优，说明本次发酵条件优化的结果较为理想，特基拉芽孢杆菌有可能会成为天然抗菌活性物质的重要资源，展现出了其较高的研究和应用价值，为后续进一步对该菌发酵产物进行分离和抗菌活性物质的分析鉴定打下基础。