klotho通过Wnt/β-catenin通路抑制高磷诱导的人主动脉平滑肌钙化

刘海军，解修花，杨秀芹，王 莹，李延国

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2临沂市人民医院)

血管钙化(Vascular calcification，VC)往往导致较差的临床结果和较大的心血管疾病风险。在慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)患者中，VC被认为是一个主要的心血管危险因素[1]。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)在VC形成过程中起着关键作用，能够将其收缩表型转变为成骨细胞和成软骨细胞样表型[2]，其中复杂的细胞内信号通路控制着VSMCs的成骨/成软骨分化[3]，是许多钙化抑制因素及钙化促进因素综合平衡的结果。Klohto作为一种抗衰老基因在健康人群及疾病患者矿物质及骨代谢过程中发挥重要作用，其缺乏已经在CKD患者中普遍存在，并被证实直接参与VC的发展。有研究显示，klotho在CKD患者中具有预防动脉钙化和减少动脉僵硬度的作用[4]。但Klotho对VC保护作用的具体机制尚不明确。本研究利用基因转染的方法，探讨Klotho对高磷诱导的人主动脉平滑肌细胞(Human aortic smooth muscle cells，HASMCs)钙化的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1HASMCs的培养及钙化的诱导 HASMC及其培养基购自ScienCell公司(美国)。将HASMC置于37℃，95% CO2孵箱中孵育，每1～2天换液1次，第3～8代用于本实验。传代后的细胞经胰蛋白酶消化后接种于六孔板中，待细胞贴壁后，换成磷浓度分别为1.3 mmol/L(正常磷浓度)、2.6 mmol/L(高磷浓度)的培养基。细胞培养时间为9 d。换用不同培养基的第1天记为第0天。直径6 cm培养皿中细胞处于对数生长期，生长状态良好时即可冻存。离心去上清液后取0.8 ml胎牛血清重悬细胞沉淀，加入80 μl二甲基亚砜混匀，封入冻存管，放入-80℃冰箱保存。

1.2klotho基因转染 转染试剂lipofectamine2000及质粒购自美国invitrogen公司。……