滇黄精营养器官的组织结构及组织化学定位研究

朱新焰，杨竹雅，杜春华，王家金，钱均祥，曾 彪，王 丽，张智慧，石亚娜，丛 琨，冷 燕，杨 雁，杜 慧，季鹏章,*

(1．云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223; 2. 云南中医药大学，云南 昆明 650500; 3. 云南技师学院，云南 昆明 650300；4. 云南省农业科学院，云南 昆明 650205; 5. 滇西科技师范学院生物技术与工程学院，云南 临沧 677000)

【研究意义】滇黄精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl)系百合科黄精属多年生草本植物，药用其根茎，是常用的药食两用的滋补中药，已有2000多年的药用历史。滇黄精是2015版《中华人民共和国药典》(一部)规定作为黄精使用的3种原生药之一[1]。其主要活性成分，黄精多糖具有免疫激发和免疫促进、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳、耐缺氧及抗应激等诸多作用[2]。滇黄精是一种价值很高的药食两用植物资源，随着近年来以滇黄精为原料的药品、保健品及日化用品的深入开发，其市场需求量日益增大，导致其野生资源稀缺，并且药材或饮片的参伪现象十分严重。因此，滇黄精的各营养器官资源值得深入研究，探索并开发其非药用部位及相关化学成分，从而可以减少资源的浪费和有效成分的流失[3-4]，对野生资源的保护及提高资源利用度有重要意义。有研究发现黄精的皂苷类成分也具有一定的药理作用；但滇黄精中皂苷类成分则缺乏系统研究[5]。【前人研究进展】组织化学定位技术已较多的利用在多糖、皂苷、黄酮、生物碱等化学成分的研究上[6-8]。对滇黄精的研究主要集中在资源分布和根茎多糖成分的提取分离等方面[9-10]。目前，除玉竹、多花黄精等药用植物的组织化学研究则有报道外[11-12]，尚未见对滇黄精各营养器官组织结构及多糖、皂苷等成分的组织化学定位的研究报道。【本研究切入点】目前，滇黄精以新鲜或干燥的根茎入药，叶、茎、根等部位则是弃而不用，造成了这些资源的严重浪费。鉴于此，采用植物组织显微技术和组织化学定位方法，研究滇黄精各营养器官的组织结构及多糖、皂苷的组织分布和积累特征，拓展资源利用范围[13]。【拟解决的关键问题】对滇黄精各营养器官的组织结构及多糖、皂苷定性和分布量进行研究分析，揭示滇黄精各营养器官的组织结构特征和主要化学成分的蕴藏量，为滇黄精资源的综合开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

滇黄精各营养器官样品均采自云南省农业科学院药用植物资源圃，经云南中医药大学杨树德教授鉴定为滇黄精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl)，样品标本均保存在云南省农业科学院药用植物标本室。

药品： 高氯酸、冰醋酸、香草醛、乙醇、高碘酸、亚硫酸氢钠、品红、偏重亚硫酸钠等试剂均为分析纯，水为纯化水。

仪器：Nikon 80i型显微镜(日本尼康公司)；HS-2026型生物组织切片机；AR124CN电子分析天平(奥豪斯上海有限公司)；TGL-16M离心机(湖南湘仪仪器有限公司)；DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱；KH5200DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)等 。

1.2 试验方法

1.2.1 组织显微结构 分别选取相同生长年限的滇黄精各器官样品，用FAA液进行固定，乙醇梯度脱水，分别进行解剖及徒手切片和石蜡制片，切片厚度约10～35 μm，制片后于显微镜下详细观察各器官组织形态、构造并拍照记录。

1.2.2 多糖组织化学定位 分别对滇黄精的根、根茎、茎及叶进行制片，各器官样品选取10张组织细胞结构完整、清晰的切片进行染色。采用高碘酸-希夫试剂进行染色反应，在不同倍数显微镜下观察多糖储存场所与分布特征。

1.2.3 皂苷组织化学定位 分别对滇黄精的根、根茎、茎及叶进行制片，各器官样品选取10张组织细胞结构完整、清晰的切片进行染色。采用等量的5 % 香草醛-冰醋酸和高氯酸试剂反应并显色后，在不同倍数显微镜下观察多糖储存场所与分布特征。

1.2.4 观察方法及数据分析 对滇黄精样品的不同器官，采用各器官分别取10张不连续的切片，每张切片的不同组织区域观察6个不同视野的方法[8]；相同显微倍数的视野观察面积均相等，如40倍时为12×104μm2，(因叶片组织切片较窄，故选视野面积为4×104μm2)；统计不同组织各观察视野中的颗粒状(或液滴状)多糖及皂苷数量，取平均值[14-15]。根据着色的细胞的多少、细胞中着色颗粒物或块状的大小、分布密度等依次划为6个等级，从低到高依次用“-”表示极少或未见；“+”表示很少；“+ +”表示较少；“+ + +”表示略多；“+ + + +”表示很多；“+ + + + +”表示极多。

2 结果与分析

2.1 滇黄精根的组织结构及多糖、皂苷的分布与积累特征

2.1.1 根的显微结构特征 根被细胞1列，排列紧密，多呈不规则四边形或椭圆形，有的呈类方形或类长方形，外侧细胞壁明显增厚。表皮细胞多为1列，多呈类六边形或不规则多边形；细胞较大，壁略厚，细胞内可见颗粒状或小块状物质。皮层较宽，黏液细胞及针晶束少数，散在，细胞较小，直径 155～280 μm。薄壁细胞中可见淀粉粒，直径3～13 μm。维管束多为外韧型，其鞘细胞类长方形，壁略增厚。导管排列较紧密，呈辐射状，直径22～87 μm。根横切面组织结构见图1。

2.1.2 根的多糖分布积累特征 多糖在根被、表皮和中柱中密度最高，这3个组织着色最深。而宽广的皮层薄壁细胞和黏液细胞中均有分布，细胞中以颗粒状多糖类物质为主。中柱鞘细胞、韧皮部及木质部细胞及导管多呈紫红色。各组织多糖分布量为皮层≥中柱>根被及表皮。多糖数量及多度见表1，多糖分布特征见图2。

2.1.3 根的皂苷分布积累特征 与根的多糖分布区域和积累量均有所不同，皂苷多数分布在表皮细胞内；靠近表皮细胞的1～3列皮层薄壁细胞和少数韧皮部细胞内有少量分布，而根被、皮层及中柱鞘细胞和维管束等部位则没有或极少分布。各组织皂苷分布量为表皮>皮层≈维管束(韧皮部)。皂苷数量及多度见表1，皂苷分布特征见图3。

表1 滇黄精根中各组织多糖、皂苷的分布量

a: 横切面(10×); b: 根被及皮层(40×); c: 维管束(40×); Mu：黏液细胞；Ve：根被；Ep：表皮；Pa：基本薄壁组织；Co：皮层；Sc：厚壁组织；Pc：维管束鞘细胞；Vb：维管束；Ph：韧皮部；Xy：木质部；Me叶肉细胞；Ra：针晶束；Sa：皂苷；Po：多糖，下同a: The cross-section (10× ); b: The velamen and cortex (40× ); c: The vascular bundles (40× ); Mu：Mucilage cell；Ve：Velamen；Ep：Epidermis；Pa：Parenchyma；Co：Cortex；Sc：Sclerenchyma；Pc：Vascular bundle sheath cell；Vb：Vascular bundle；Ph：Phloem；Xy：Xylem；Me: Mesophyll cell；Ra：Raphides；Sa：Saponin；Po：Polysaccharide, the same as below图1 根组织结构Fig.1 The tissue structure of root

图2 根多糖分布Fig.2 Distribution of polysaccharides in root

图3 根皂苷分布Fig.3 Distribution of saponins in root

表2 滇黄精根茎中各组织多糖、皂苷的分布量

2.2 滇黄精根茎的组织结构及多糖、皂苷的分布与积累特征

2.2.1 根茎的显微结构特征 表皮细胞 1 列，多呈类长圆形或不规则多边形，细胞壁略增厚，波状排列，外被角质层。皮层宽，有黏液细胞散在；内皮层细胞 1 列，可见细胞凯氏点。黏液细胞与草酸钙针晶束多数甚大，散布于皮层中，直径约 210～435 μm，针晶长 60～205 μm。基本薄壁组织细胞大小不一，不规则形，可见较大单粒及复粒淀粉粒，直径7～20 μm，复粒多由2～3分粒组成。维管束散列，周木型，近内皮层处维管束外韧型。导管较小，直径10～65 μm。根茎横切面组织结构见图4。

2.2.2 根茎多糖分布与积累特征 根茎多糖主要分布在表皮和大多数皮层基本薄壁细胞、黏液细胞和维管束中。角质层、表皮、韧皮部及木质部细胞均显紫红色，皮层薄壁细胞壁均显红色，而细胞质中以颗粒状多糖物质为主；有的可见单粒或复粒淀粉粒。该器官不同组织多糖分布量为皮层>维管束>表皮。多糖数量及多度见表2，多糖分布特征见图5。

2.2.3 根茎皂苷分布与积累特征 根茎皂苷主要分布在表皮细胞、皮层薄壁细胞及木质部细胞中；内皮层以内的薄壁组织细胞中则分布较少，而黏液细胞中则没有分布。表皮及表皮以内3～5层细胞质中可见较多的小团块状、颗粒状皂苷类物质，这些组织的细胞壁通常也着色较深；而韧皮部细胞则不显色。组织皂苷分布量为皮层>维管束>表皮。皂苷数量及多度见表2，皂苷分布特征见图6。

a：横切面(4×)； b：表皮及皮层(40×)； c： 维管束(40×), 下同a: The cross-section (4× ); b: The epidermis and cortex (40× ); c: The vascular bundles (40× ), the same as below图4 根茎组织结构Fig.4 Tissue structure of rootstock

图5 根茎多糖分布Fig.5 Distribution of polysaccharides in rootstock

图6 根茎皂苷分布Fig.6 Distribution of saponins in rootstock

图7 茎组织结构Fig.7 Tissue structure of stem

2.3 滇黄精茎的组织结构及多糖、皂苷的分布与积累特征

2.3.1 茎的显微结构特征 表皮细胞 1 列，呈类圆形或类方形，细胞排列紧密，稍弯曲。厚壁组织以外皮层较窄，常由4～6层细胞组成，大小较均匀；可见较多的小块状物质及淀粉粒，直径4～15 μm。厚壁组织由3～4层细胞组成，较窄处仅有1层细胞，主要由木纤维组成。厚壁组织内侧皮层较宽，细胞排列较疏松，大小不一，块状、颗粒状物质少见。皮层偶见黏液细胞及针晶束。维管束散列，外韧型，近厚壁组织处多为周韧型，导管偏小，直径18～46 μm。茎横切面组织结构见图7。

2.3.2 茎多糖分布与积累特征 茎多糖主要分布在厚壁组织外侧的皮层、纤维束环(厚壁组织)和维管束中。表皮细胞中有少量多糖分布，而纤维束环以内的皮层组织中则分布极少。厚壁组织及维管束细胞均着紫色或红色，皮层薄壁组织则可见颗粒状或块状多糖累物质。茎中各组织多糖分布量为维管束≥厚壁组织>厚壁组织外侧皮层>表皮≈厚壁组织内侧薄壁组织。多糖数量及多度见表3，多糖分布特征见图8。

2.3.3 茎皂苷分布与积累特征 茎皂苷主要分布在厚壁组织及表皮细胞中，皮层(厚壁组织外侧)和韧皮部细胞中有少量分布，内侧皮层则分布极少。厚壁组织显黄色，表皮和韧皮部细胞显浅红色，而皮层有部分细胞则显绿色，显示茎中不仅有三帖皂苷，还可能有甾体皂苷。各组织皂苷分布量为厚壁组织>厚壁组织外侧皮层>表皮>维管束>厚壁组织内侧薄壁组织≈0。皂苷数量及多度见表3，皂苷分布特征见图9。

表3 滇黄精茎中各组织多糖、皂苷的分布量

图8 茎多糖分布Fig.8 Distribution of polysaccharides in stem

图9 茎皂苷分布Fig.9 Distribution of saponins in stem

2.4 滇黄精叶的组织结构及多糖、皂苷的分布与积累特征

2.4.1 叶的显微结构特征 叶为等面叶，由表皮、叶肉及叶脉组成。上下表皮细胞各 1 列，多呈长方形或类方形，有的类圆形或不规则形，排列紧密。叶肉薄壁细胞5～6层，类椭圆形，排列不甚紧密，细胞内可见大量叶绿体。维管束由初生木质部、韧皮部组成，韧皮部位于下表皮一侧，木质部由导管、管胞和木纤维组成，导管直径约22～30 μm。叶片横切面组织结构见图10。

2.4.2 叶片多糖分布与积累特征 多糖集中分布在叶肉薄壁组织细胞和叶脉中；表皮细胞中有少量多糖，其细胞壁显淡红色。多数叶肉薄壁组织细胞、维管束韧皮部及木质部细胞均显紫色或红色，这些部位有大量多糖存在；叶肉细胞中以淀粉粒类多糖最为常见。叶中不同组织多糖分布量顺序为叶肉细胞>叶脉>表皮；多糖数量及多度见表4，多糖分布特征见图11。

2.4.3 叶片皂苷分布与积累特征 与多糖分布有所不同，皂苷主要集中在叶肉薄壁细胞中，其次为上、下表皮细胞，而维管束中则基本没有分布。叶肉及表皮细胞均显淡紫色或粉红色，维管束韧皮部则显淡黄色，只有极少皂苷分布。各组织皂苷分布量为叶肉细胞>表皮>叶脉。多糖数量及多度见表4，皂苷分布特征见图12。

2.5 滇黄精各营养器官多糖、皂苷分布量比较

在相同观察视野面积下，对各营养器官内多糖、皂苷的分布进行统计分析，多糖与皂苷在各营养器官中的平均分布量由多到少均为根茎>叶片>茎>根。平均分布量及分布密度比较见表5、图13。

3 讨 论

通过对滇黄精4种营养器官的解剖与切片观察，阐明并测量出了黏液细胞、针晶体、导管、淀粉粒等组织细胞的形态、大小等特征。经过组织化学定位，明确了滇黄精2种主要次生代谢产物的分布场所、数量和密度；根和叶的次生代谢产物分布较为均匀，绝大多数分布在皮层薄壁细胞、叶肉细胞及维管束中。而根茎和茎中次生代谢产物则出现组织分布不均匀的情况。茎中两类物质以厚壁组织外侧薄壁组织、厚壁组织、维管束3个区域内居多，而厚壁组织内侧皮层则分布很少；可能与输导组织径向输送物质而形成的屏障有关。根茎则以外皮层和维管束中的分布密度较高，这与植物基本薄壁组织储藏代谢产物的功能相统一。黏液细胞中均有多糖分布，而未见皂苷类物质。由此可见，在一些药材良种选育时，以某些器官中基本薄壁组织的厚薄及黏液细胞的数量作为一个重要指标，具有一定的指导意义。

表4 滇黄精叶中各组织多糖、皂苷的分布量

a：横切面(10×)； b：主脉维管束(40×)；c：表皮、叶肉细胞及侧脉维管束(40×)，下同a:The cross-section (10×); b: The major vein (40×);c: The epidermis, mesophyll cells and lateral vein (40×), the same as below图10 叶片组织结构Fig.10 Tissue structure of leaf

图11 叶片多糖分布Fig.11 Distribution of polysaccharides in leaf

图12 叶片皂苷分布Fig.12 Distribution of saponins in leaf

表5 滇黄精各器官多糖、皂苷分布量分析

图13 滇黄精各营养器官多糖及皂苷分布量Fig.13 Distribution of polysaccharides and saponins in different organs of Polygonatum kingianum

值得注意的有2点，一是皂苷类物质在滇黄精中也有较高的分布量，近年来也有对黄精类药材中非多糖成分的研究报道，但某些成分的药理活性尚不明确，后续研究工作中有待进一步对该类药材的皂苷及其它类成分进一步研究。二是若将显微视野观察面积定为12×104μm2，叶片多糖与皂苷平均分布量分别占根茎的62 %和57 %左右；这可能与叶片表面积较大，在进行光合作用时合成了较多的糖类物质有关。茎中多糖和皂苷亦分别占根茎的29 % 和44 %。另外，叶和茎等非药用部位占滇黄精的总生物量约25 %～30 %，而在该类药材的利用中，叶片等部位是弃而不用的。近年来，随着滇黄精类药材需求量的不断提高，药材价格也在不断攀升，野生资源不断衰竭，而栽培品系又不能及时供给市场，导致了饮片、生药的混伪品充斥市场，该项研究可为滇黄精叶片等部位的综合开发与利用提供参考依据。

4 结 论

研究结果揭示了滇黄精各器官的组织构造特征，可以作为滇黄精基源植物、药材、饮片等的鉴别依据；明确了滇黄精的各营养器官的各组织多糖和皂苷的储存场所和分布特征。目前，对黄精类药材的化学成分的研究主要体现在多糖类物质方面，皂苷类化学成分的研究鲜见报道；而实验结果显示，滇黄精各营养器官中均含有一定量的皂苷类物质。因此，应重视对皂苷类化学成分的深入研究；同时，也需要加大对滇黄精地上营养器官的发掘，从而提高药效成分及该类药用植物资源的综合利用度。