新疆厚皮甜瓜采后病害真菌的鉴定及多样性分析

郑贺云,耿新丽,姚 军,张翠环,廖新福

(新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善 838200)

【研究意义】甜瓜属于葫芦科(Cuculacere)黄瓜属(Cuccmis.L)甜瓜种(CucumismelonL.)，一年生蔓生草本植物。在我国种植历史悠久，种植面积和产量均居世界第一，既是新疆的特色名优果蔬资源，又是新疆发展特色农业的主要经济支柱之一[1]，甜瓜果实不仅外观精美、汁多味甜、气味芳香，而且还含有丰富的类胡萝卜素、维生素C、氨基酸等营养成分，近年来备受广大国内外消费者的青睐。新鲜的甜瓜含水量和含糖量都较高，采摘后仍进行生理代谢，采收时正处于高温季节，再加上新疆地处偏远的西北，缺乏合理的包装和有效的冷链物流，采后容易受病原菌的浸染[2]，导致果实腐烂、品质和外观急速下降，这是制约新疆甜瓜产业的发展的最大瓶颈。【前人研究进展】对甜瓜采后病害的主要致病菌的报道的已有20多种[3]，链格孢(Alternaria)、镰刀菌(Fusarium)、粉红单端孢(Trichothecium.)、根霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)是造成新疆产区甜瓜贮藏期间发病腐烂的主要病原微生物，分别引起黑斑病、白霉病、粉霉病、软腐病和绿霉病[4]。【本研究切入点】近年来，对甜瓜采后研究方向都倾向于单一品种病原菌的分离、鉴定和贮藏保鲜的技术研究，而对采后不同品种甜瓜被病原菌侵染的种类和群落结构的研究报道尚少。【拟解决的关键问题】本研究以西州密17号、金龙和水晶绿甜瓜为研究对象，对引起甜瓜果实采后病害病原菌的种类和群落结构进行分析，以期为有效防治甜瓜采后病害提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品处理

甜瓜果实：水晶绿甜瓜(老姑娘)2018年购买自新疆阿克陶县，西州密17号和金龙2个品种采自新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所试验基地。采集成熟度基本一致、大小一致、无机械损伤、无病虫害的果实为试验材料，将这3个甜瓜品种放置室温(23～25 ℃)条件下贮藏，使其自然发病。

1.2 菌株的分离纯化

果实自然发病果面长出霉层或菌丝后，挑取果面上的菌丝接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(购至广东环凯微生物科技有限公司)上，放置28 ℃的恒温培养箱中进行培养。采用划线法纯化菌株，挑取单菌落接种到新的PDA培养基上，28 ℃恒温培养，并将菌株保存在PDA斜面上备用。

1.3 甜瓜采后病害rDNA-ITS序列分析

1.3.1 基因组总DNA的提取 采用改进的CTAB法[6]提取供试菌株的基因组总DNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 PCR扩增及检测 利用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)的通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[7]对菌株的基因组DNA进行扩增，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。扩增体系(50 μl)：正向引物(10 μM)和反向引物(10 μM)各1 μl，DNA模板1 μl，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μl(试剂购自全式金生物)，用无菌ddH2O补充至50 μl。反应程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃(依照合成的引物确定)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物检测方法：取3 μl产物，利用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，之后利用凝胶成像系统观察拍照[8]。

1.3.3 PCR产物测序及系统进化树的构建 供试菌株的PCR产物测序后(生工生物工程(上海)有限公司完成)，所获得的序列与 GenBank 数据库中的已知序列进行BLAST同源性比对，获得与供试菌株的rDNA-ITS序列同源性较高区，用Clustal X (version 1.83) 软件的Alignment 程序进行多重比对(Multiplealignment)，采用 Mega (Version 4.0) 软件包邻接法 (neighbor-joining) 构建分子系统发育树，用Bootstrap自展数据集为1000 次对系统发育树置信度进行检测[9]。

1.4 多样性分析

1.5 相似性分析

对不同品种甜瓜采后病原真菌群落组成的相似性水平进行Jaccrad相似性指数(Cj)比对，分析2个品种中病原菌种类组成的相似程度。其公式为：Cj=c/(a+b-c)，式中，a、b分别为2个种品种类型中病原菌种数，c为2个品种类型中共有的病原菌种数[12]。

2 结果与分析

2.1 构建ITS区rDNA系统进化树分析

对45株菌株的rDNA-ITS基因序列测定，得到45条有效序列。将rDNA-ITS基因序列在NCBI网站上进行Blast比对，从GenBank数据库中搜索其同源序列，并利用MEGA4软件构建系统进化树。

从图1和表1可知，从西州密17号甜瓜果实上分离出的27株菌分别属于5个不同的属， 分别为Fusarium、Penicillium、Aspergillus、Botryotinia和Rhizoctonia，其中18株镰刀菌中39号菌株ITS序列与有效发表的菌株Fusariumchlamydosporumstrain FC1B(EU556725.1)的相似度为97.31 %，但在系统发育树上两者距离较近但没有单独聚类成一个小分支，52号菌株ITS序列与有效发表的菌株Fusariumoxysporumisolate LrBF2(MG543720.1)的序列相似度为97.91 %，在系统发育树上单独聚在一个分支，由于镰刀菌属种类较多，种内遗传分化水平也较高，形态也存在变异性和多型性，分类较为困难，因此还需对这两株菌进一步的深入研究研究，从而准确确定其系统发育地位；剩余15株镰刀菌株ITS序列与有效发表的菌株序列相似度在99 %以上，33号菌株与Fusariumbrachygibbosum(KU528864.1)的相似度为99.81 %，但是在之前甜瓜采后病害中没有相关菌株的报道，需进一步研究该菌株对甜瓜的侵染方式以及发病情况。

从金龙甜瓜上分离出的7株菌分别属于Aspergillus、Penicillium和Fusarium3个属的6个种，ITS序列与有效发表的菌株序列相似度都在99 %以上。

从水晶绿甜瓜上分离出的11株菌，分别属于Diplodiaseriata、Alternaria、Fusarium和Penicillium。镰刀菌属5株，其中编号72-1的菌株的ITS序列与有效发表的菌株Fusariumgraminearumisolate 23(MF800907.1)的序列相似度为97.63 %，在系统发育树上两者却相距甚远，有可能为Fusarium潜在的新种，其分类地位有待研究，其它菌株的ITS序列与有效发表的菌株序列相似度在99 %以上，但是Diplodiaseriata、Fusariumgraminearum和Fusariumproliferatum之前在甜瓜采后病害中均未见报道，因此编号为80、76、79-1的菌株侵染甜瓜的方式及发病情况应做进一步分析研究。

表1 分离菌株rDNA-ITS 序列相似性分析

续表1 Continued table 1

菌株编号Strain No.来源Source所在属Genus近似种The nearnest type strain相似度(%)Identity41西州密17号镰刀菌属Gibberella moniliformis strain P6-26(GU723435.1)99.4245西州密17号镰刀菌属Fusarium incarnatum strain LH26(MG808373.1)99.4241-2西州密17号镰刀菌属Fusarium oxysporum isolate Fox3(KU528847.1)99.4252西州密17号镰刀菌属Fusarium oxysporum isolate LrBF2(MG543720.1)97.915西州密17号镰刀菌属Neocosmospora rubicola strain HLGJF1501(MH277488.1)99.2618西州密17号镰刀菌属Fusarium solani strain G245(KF572442.1)99.0841-1西州密17号镰刀菌属Fusarium solani isolate Fs(KC156599.1)99.6243西州密17号镰刀菌属Fusarium solani isolate Fs6(KC156598.1)99.6251西州密17号镰刀菌属Fusarium solani isolate Fs2(KC156594.1)99.2654西州密17号镰刀菌属Fusarium solani isolate ITS-4(KY662483.1)99.086西州密17号镰刀菌属Fusarium solani isolate Fso8(KU528858.1)99.444-3金龙青霉菌属Penicillium cinnamopurpureum strain SCAU150(MF135513.1)99.072-1金龙曲霉属Aspergillus niger isolate S13(MG654699.1)99.8235-2金龙曲霉属Aspergillus flavus strain aC4(KU561919.1)99.4635金龙曲霉属Aspergillus ochraceus internal(KU743890.1)99.2864金龙曲霉属Aspergillus flavus isolate MC-5-L(KU527785.1)99.653-1金龙镰刀菌属Fusarium oxysporum isolate B5Fo(MH368295.1)99.253-2金龙镰刀菌属Fusarium solani isolate G6(MF800959.1)99.2672水晶绿甜瓜青霉菌属Penicillium oxalicum strain SCSAAF0017(JQ647900.1)99.4680水晶绿甜瓜色二孢属Diplodia seriata isolate Bot-2018-S22(MH675476.1)99.4672-2水晶绿甜瓜链格孢属Alternaria alternata strain MS18-2(KU324787.1)99.6375水晶绿甜瓜链格孢属Alternaria alternata strain ITCC-4312(MH084279.1)99.8178水晶绿甜瓜链格孢属Alternaria tenuissima isolate ZB11263537(KX783377.1)99.8181-1水晶绿甜瓜链格孢属Alternaria alternata isolate KS48T5L(KF380824.1)10070水晶绿甜瓜镰刀菌属Fusarium chlamydosporum isolate DS09(KY432359.1)99.2271水晶绿甜瓜镰刀菌属Fusarium chlamydosporum isolate LrSF22(MG543702.1)99.6172-1水晶绿甜瓜镰刀菌属Fusarium equiseti isolate 5-10-F_G04(KX529083.1)97.6376水晶绿甜瓜镰刀菌属Fusarium graminearum isolate 23(MF800907.1)99.6179-1水晶绿甜瓜镰刀菌属Fusarium proliferatum strain BH28(MH712158.1)99.81

图1 从西州密17号甜瓜果实中分离出的菌株系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of fungus strain in Xizhoumi-17 melon fruit

图2 从金龙甜瓜果实中分离出的菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of fungus strain in Jinlong melon fruit

图3 从金龙甜瓜果实中分离出的菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of fungus strain in Shuijinglv melon fruit

2.2 甜瓜采后病原真菌种类与分离频率

由表2可知，从腐烂的甜瓜上分离出真菌菌株45株，分别为Fusarium、Aspergillus、Penicillium、Alternaria、Rhizoctonia、Diplodia、Botryotinia7个属20个种，其中Fusarium是优势种群，分离频率达到55.56 %；其次是Aspergillus，分离频率为20 %；Penicillium

表2 甜瓜采后病原真菌种类与分离频率

和Alternaria的分离频率为8.89 %；Rhizoctonia、Diplodia和Botryotinia的分离频率均为2.22 %，较为稀少。

由表3可知，不同甜瓜品种采后病原菌的群落和结构之间存在一定的差异。3个甜瓜品种中，从西州密17号分离出的病原菌最多分属5个属，其中Fusarium18株为优势种群，占西州密17号菌株总数相对分离频率的40 %，其次是Aspergillus共5株占11.1 %；从水晶绿甜瓜中分离到的菌株分布在4个属中，Fusarium5株，Alternaria4株，Penicillium1株，Diplodia1株，分别占水晶绿甜瓜菌株总数的相对分离频率的11.1 %、8.9 %、2.2 %和2.2 %，金龙分属3个属，分离出的Aspergillus较多，共计4株，占金龙菌株总数相对分离频率的8.9 %，Fusarium和Penicillium相对较少，分别为4.4 %和2.2 %。

2.3 不同甜瓜品种采后病原真菌多样性特点

从表4可知，3个甜瓜品种采后病原菌群落间的多样性水平存在差异。从病原真菌的数量上看，西州密17号的多样性指数最高，一共分离出5个菌属27株菌，水晶绿甜瓜分离出4个属11株菌，而金龙的最低，只分离出3个属7株菌；从多样性水平来看，西州密17号分离出的菌群多样性指数、均匀度指数和丰富度指数都最高，分别为0.91、0.28、6.83，金龙菌群多样性指数、均匀度指数和丰富度指数都为最低，分别为0.44、0.23和1.58。

2.4 不同甜瓜品种采后病原菌的相似性

3个甜瓜品种采后病原菌菌群相似性系数在0.286～0.400，金龙与水晶绿甜瓜2个甜瓜品种采后病原真菌群落相似性系数最高为0.400，而西州密17号与水晶绿甜瓜采后病原真菌群落的菌群相似性系数最低为0.286。根据Jaccrad相似性原理，3个甜瓜品种的病害真菌群落相似性系数处于不相似或中等不相似之间。总体而言，3个甜瓜品种采后病害真菌间的相似度均较低。

表3 不同品种甜瓜采后病原菌种类与相对分离频率

表4 不同甜瓜品种采后病原真菌群落的多样性水平

表5 不同甜瓜品种采后真菌群落相似性系数

3 讨 论

新疆厚皮甜瓜近年来具有较高的经济价值，但是采后贮藏与运输过程中有侵染型病害发生，不仅降低果实的品质，甚至失去原有的商品价值，造成巨大的经济损失。已报道的引起甜瓜采后腐烂的主要病原菌有Alternaria、Fusarium、Penicillium[13]、Phomadestructiva、Fusariumoxysporm、Penicilliumdigitatum、Alternariatenuis、Curvularialunata、Fusariumequiseti、Trichotheciumroseum[14]、Aspergillus、Mucor、Rhizoctoniasolani[15]、Phomopsisbrevistylospora[16]等，甜瓜采后病害发生的种类较多，不同病害发生的时期与条件也有所不同，不同品种的主要致病菌也有所不同，例如，Alternariaalternata和Trichotheciumroseum是“黄河蜜”采后贮藏运输过程中的主要病害[17]；宁夏中部干旱带甜瓜“玉金香”的主要病原菌是Alternaria、Trichothecium、Fusarium、Paecilomyces[18]；张有林等人研究伽师瓜采后贮藏病害表明，贮藏期果实主要受Moniliaceae、Penicillium和P.viridicatumWestling的侵染[19]；引起白兰瓜腐烂的病原菌主要是FusariumlateritiumNees，Cephalotheciumroseum，Aspergillusspp.，Penicillium，Rhizopusstolonifer，其中F.lateritiumNees危害最为严重[20]。本研究从西州密17号、金龙、水晶绿甜瓜(老姑娘)3个甜瓜品种自然发病的果实上分离纯化出45株病原菌，rDNA-ITS序列比对分析，分别属于Fusarium、Penicillium、Alternaria、Aspergillus、Penicillium、Rhizoctonia、Diplodia、Botryotiniafuckeliana等7个真菌属，其中Diplodia则是首次在西北甜瓜产区中国分离得到的采后病菌，由此说明，造成甜瓜采后腐烂变质的病原菌种类丰富多样且不断增加。

样品的病原菌群落多样性可用多样性指数(香浓-威尔森指数)反映，病原菌种群分布特点的重要指标是均匀度指数，丰富度指数是反映病原菌种属丰富性的重要指数，而两个不同品种间病原菌群落组成的相似程度则用相似性系数反映。本研究对西州密17号、金龙和水晶绿甜瓜3个甜瓜品种的病原菌进行分析，从西州密17号分离到的27株菌分布在5个属中，多样性指数、丰富度都为最高，分别为0.918、0.683，优势菌群为Fusarium；从水晶绿甜瓜中分离出11株菌分别属于Fusarium、Alternaria、Penicillium和Diplodia，多样性指数为0.628，丰富度为2.627，Fusarium占主要优势；从金龙中只分离到7株菌，多样性指数和丰富度都为最低只有0.438、1.576，Aspergillus较多。从3个地区分离到的菌株组成相似度来分析，3个品种之间真菌组成虽有不同但是差异不显著，感染的菌株总体仍以Fusarium为主，由此可见，不同的甜瓜品种采后分离的病原菌数量、种类及群落多样性水平具有较大差异，但是相似度较低，造成甜瓜采后腐烂变质的主要原因是由于多种病原菌的侵染，不同地区、不同甜瓜品种发生病害的种类有一定的差异。近年来，随着甜瓜品种的增加，各地区栽培模式的不同，采后造成果实腐败腐烂的病原菌的多样性和结构都会发生很大变化，因此，研究不同地区和不同品种的甜瓜采后病原菌为研究者提供大量的理论基础，为贮藏和运输中的病害防治具有重要的意义。

4 结 论

通过对室温条件下贮藏的西州密17号、金龙、水晶绿甜瓜自然发病的果实进行病原菌的分离并结合ITS序列的鉴定，分离到的45个菌株分别为Fusarium、Aspergillus、Penicillium、Alternaria、Rhizoctonia、Diplodia、Botryotinia7个属20个种，其中引起西州密17号和水晶绿甜瓜的病原菌以Fusarium为优势菌群，而从金龙的果实上分离的Penicillium则较多，由此说明不同甜瓜品种受不同病原菌的侵害；通过对不同品种的甜瓜采后病害多样性及病原菌相似性分析，不同的甜瓜品种采后分离的病原菌数量、种类及群落多样性水平具有较大差异，但是相似度较低，由此来说甜瓜采后腐烂变质的主要原因是由于多种病原菌的侵染，不同地区、不同甜瓜品种发生病害的种类有交叉也有一定的差异。