不同湿地植物脱氮效果与根际土壤微生物群落功能多样性特征分析

潘福霞, 来晓双, 李 欣, 赵玉强, 王树志, 王 惠

1.济南市环境研究院, 山东 济南 250100 2.济南大学水利与环境学院, 山东 济南 250022

人工湿地是指由人工建造和控制运行的湿地系统，通过植物-微生物-基质系统的物理、化学、生物协同作用来实现对污水的高效净化[1]，与传统污水处理方法相比，人工湿地具有建设费用低、运行费用低、处理效果好等优点，被广泛用于处理农村生活污水、污水厂尾水以及微污染的河水[2-3].

2017年全国环境统计公报数据显示，我国工业源氨氮、农业源氨氮、城镇生活氨氮排放量分别为21.7×104、72.6×104、134.1×104t[4]，氮是主要的富营养化元素之一，并且以多种形态存在于水体环境中，是威胁水环境安全的重要因子，因此对人工湿地脱氮效果的研究尤为重要. 湿地植物可直接吸收利用水体中的氮素，通过收割可将其从湿地中去除[5]. 但李林锋等[6]研究表明，收割植物地上部分在人工湿地系统氮去除中并非重要措施，并且不同植物间差异较大，去除率范围为0.3%～14.1%，湿地植物更多的是发挥间接生态效应. LIN等[7]研究表明，88%～96%的硝态氮是通过微生物的反硝化过程去除的. HU等[8]采用15N同位素标记方法研究复合垂直流人工湿地NH4+去除率，表明约75.2%～85.6%的NH4+是通过硝化-反硝化和厌氧氨氧化微生物转化去除的，可见微生物在脱氮过程中居主导地位. 湿地植物发挥生态效应的重要方面之一是植物根对微生物活性和群落组成的影响，植物根际对微生物的影响主要表现在2个方面：①为微生物提供能源物质，植物根系向土壤中释放大量糖类、醇类和酸类等分泌物，这些碳源可促进微生物的生长繁殖，同时细根的腐解也向土壤中补充了有机碳，为异养微生物提供能源，促进微生物生长繁殖[9]；②植物根系泌氧为好氧微生物提供适宜生境，在整体还原态的基质中，形成了根区氧化态的微环境，为好氧、兼性、厌氧微生物提供适宜生境，增加微生物种类，有利于微生物对污染物的降解，促进了人工湿地净化效果[10-11]. 可见，植物对基质中微生物的影响直接关系到氮素的去除效率. 研究表明，植物的根系形态、结构和生理生态特征与养分去除率密切相关[12]，不同种类植物的总有机碳释放速率存在显著差异，其范围为 0.171 5～0.922 1 mg/(g·d)(以根干质量计)[13]，植物种类对总氮和铵态氮的去除率有显著影响，相同水力负荷下表现为旱伞草(长根型)>花叶芦竹(中根型)>黄菖蒲(短根型)[14]，因此，了解不同湿地植物根际效应对微生物群落功能多样性的影响是探究人工湿地脱氮机制的重要方面之一.

Biolog法是研究微生物代谢功能多样性的有效方法，能够摆脱传统分离纯菌的限制而获得微生物群落总体活性与代谢功能的信息[15]. Biolog生态板有31种碳源，通过微生物对多种碳底物的不同利用差异来反映微生物群落生理特征的变化，是描述微生物群落总体活性与代谢功能多样性的一种简单、快速的方法[16]. 湿地植物种类众多，应优先选择乡土植物、养护管理要求低、对环境友好的植物种类. 北方地区冬季寒冷，在植物选择上需考虑其耐寒性，芦苇和香蒲抗寒能力强，为多年生植物，易于管理、较易成活、成本低，在北方湿地中应用较广. 该研究以芦苇和香蒲为研究对象，在水平潜流型人工湿地原位采集土壤样品，比较不同湿地植物根际效应对微生物活性的影响，以期为水平潜流型人工湿地植物-微生物-土壤(基质)系统中氮去除提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 供试水平潜流型人工湿地

供试水平潜流型人工湿地位于济南市长清区的西区污水厂，共7个湿地单元，每个湿地单元长6 m，宽4 m. 该湿地主要采用原土、粗砂和砾石作为填料，基质层厚度为1.05 m，基质层由上到下依次为土壤种植层、粗砂层、5～10 mm砾石层、10～30 mm砾石层、30～70 mm砾石层、70～100 mm砾石层、粗砂层，各层厚度依次为0.20、0.10、0.15、0.15、0.15、0.30、0.10 m. 湿地进水为污水厂处理的尾水，ρ(DO)、ρ(CODCr)、ρ(NH4+)、ρ(TN)、ρ(TP)分别为7.99、24.24、2.28、32.79、2.01 mg/L，人工湿地水力负荷为0.33 m3/(m2·d).

水平潜流型人工湿地种植植物为北方地区常用的香蒲和芦苇，其中，1、3、5号湿地单元种植芦苇，2、4、6号湿地单元种植香蒲，7号湿地不种植物做空白对照. 2017年2月移栽芦苇和香蒲，于根袋(孔径为0.074 mm)中装入2 kg土壤，将芦苇和香蒲分别种植于根袋中，再将根袋埋到土壤层中. 2017年8月30日芦苇和香蒲生长旺盛期采集土壤样品，分别采集1、3、5号湿地单元中芦苇根际土壤(简称“LR”)和2、4、6号湿地单元中香蒲根际土壤(简称“XR”)，采集7号地中不种植物的土壤作为对照(简称“CK”)，采集的土壤样品用于测定土壤理化性质和微生物群落功能多样性.

1.2 水质监测

水质监测从8月9日开始，每5 d采集1次，采样后立即测定ρ(TN)和ρ(NH3-N). 采用《水和废水检测分析方法》[17]中的方法进行测定.

1.3 土壤样品理化性质测定

土壤pH采用土水比为1∶5(4 g土加入20 mL水)的土壤悬浮液测定[18]. 土壤样品用2 mol/L KCl浸提(5 g土加入25 mL KCl溶液浸提)后用流动分析仪(FIA QC8500，Lachat，美国)测定w(NH4+)、w(NO3-)、w(NO2-)[18]. 土壤样品经超纯水浸提(5 g土加入25 mL超纯水浸提)后用总有机碳分析仪(TOC-V CPH，SHIMADZU，日本)测定可溶性有机碳浓度[18].

1.4 土壤微生物碳源利用特征分析

称取新鲜土壤10 g(以干物质计)于灭菌锥形瓶中，加入90 mL灭菌生理盐水(0.85% NaCl溶液)，以200 r/min振荡30 min，静置10 min后，依次稀释至 1 000 倍，接种至Biolog生态板上，每孔加样量为150 μL. 在25 ℃培养箱中培养7 d，分别于24、48、72、96、120、144 h在590 nm测定每孔的吸光值[19].

土壤微生物碳源利用指标有微生物代谢活性、碳源利用丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数和Shannon-Wiener 均匀度指数，各指标计算方法参考文献[20].

微生物的代谢活性采用AWCD (average well color development，颜色平均变化趋势)表示，计算公式：

(1)

式中，ODi为第i个孔的吸光值与空白对照孔吸光值之差.

碳源利用丰富度指数(S)用颜色变化的孔数表征.

Shannon-Wiener多样性指数(H)计算公式：

(2)

(3)

式中，Pi为第i孔的相对吸光值与整个微平板所有孔中相对吸光值总和的比值.

Shannon-Wiener均匀度指数(E)：

E=H/lgS

(4)

1.5 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 19.0软件进行数据分析，采用单因素(one-way ANOVA)和邓肯(Duncan)法进行方差分析和差异显著性比较，采用Sigmaplot 12.5软件作图.

2 结果与分析

2.1 污水TN和NH3-N去除率

对人工湿地出水的ρ(NH3)和ρ(TN)进行了测定，结果表明不同处理中NH3-N去除率均高于44%，TN去除率均高于41%. 由图1可见：LR和XR的NH3-N去除率均高于CK，LR的NH3-N去除率较CK高12%～30%，XR的NH3-N去除率较CK高7%～33%；XR的TN去除率较CK高10%～24%，除8月19日LR的TN去除率低于CK外，其余均高于CK.

2.2 土壤理化性质

由表1可见：LR和XR的pH均低于CK；而LR和XR的w(DOC)和w(NH4+)均显著高于CK; XR的w(NO3-)显著高于CK，而LR的w(NO3-)则与CK无显著差异; XR的w(DOC)和w(NO3-)均显著高于LR.

2.3 土壤微生物碳源利用比较分析

AWCD是反映土壤微生物代谢活性的重要指标. 由图2可见：随培养时间的延长，土壤微生物的总碳源代谢强度呈逐渐增加趋势，培养24～120 h内呈线性增加，培养148 h后趋于稳定；LR和XR的土壤微生物碳源利用率增加速度显著快于CK，XR土壤微生物碳源利用率高于LR.

表1 土壤理化性质

注：不同小写字母表示差异性检测达到显著水平(p<0.05).

图2 土壤微生物群落AWCD分析Fig.2 Changes in average well color development with incubation time

按照Gryta等[21]的方法将31种碳源分为5类，分别为聚合物类、碳水化合物类、氨基酸类、羧酸和酮酸类、胺类. 由图3可见：LR和XR的土壤微生物均表现为对碳水化合物类碳源的相对利用率最高，均在48.0%以上. LR的土壤微生物对氨基酸类、聚合物类、羧酸和酮酸类碳源的相对利用率基本一致，分别为18.9%、17.0%、16.3%. XR的土壤微生物对羧酸和酮酸类碳源的相对利用率仅次于碳水化合物类，为27.0%；其次是氨基酸类碳源，为19.6%. CK的土壤微生物对碳水化合物类和聚合物类碳源的相对利用率均较高，分别为34.4%和32.7%；其次是氨基酸类以及羧酸和酮酸类碳源，分别为15.9%和14.4%.

2.4 土壤微生物多样性指数分析

由表2可见：LR和XR土壤微生物的碳源利用丰富度指数分别为22和23，比CK分别增加了47.0%和53.0%；LR和XR土壤微生物的Shannon-Wiener多样性指数分别为1.29和1.17，比CK分别增加了61.3%和46.3%；LR和XR土壤微生物的Shannon-Wiener均匀度指数分别为0.96和0.85，比CK分别增加了41.2%和25.0%. LR和XR土壤微生物的丰富度指数、多样性指数和均匀度指数均显著高于对照土壤.

图3 培养96 h后土壤微生物对碳源的相对利用率Fig.3 Relative microbial utilization rate of carbon sources after incubate for 96 h

表2 土壤微生物多样性指标分析结果

注：不同小写字母表示差异性检测达到显著水平(p<0.05).

图4 培养96 h后土壤微生物群落碳源利用特征的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of soil microbial community carbon source utilization after incubate for 96 h

2.5 土壤微生物群落碳源利用特征的主成分分析

选取微生物对数生长期(96 h)的AWCD值做主成分分析，PC1和PC2的累积贡献率达61.7%，基本可以表征原来31个变量的特征，因此取前2个主成分作图表征不同土壤微生物群落碳源代谢特征. 由图4可见，种植植物的根际土壤(LR和XR)与CK完全区分开，LR和XR集中在PC1正端和PC2负端，CK集中在PC1负端和PC2正端，说明种植植物的根际土壤和对照土壤的微生物对碳源利用率存在显著差异，而LR与XR的土壤微生物对碳源利用多样性不能完全区分，说明不同植物对土壤微生物碳源利用多样性的影响较小.

3 讨论

3.1 种植植物对脱氮效率的影响

该研究中种植芦苇和香蒲均增加了水平潜流型人工湿地出水NH3-N的去除效率，种植香蒲增加了TN的去除效率. 奉小忧等[22]在模拟人工湿地上研究了菖蒲、香蒲、千屈菜、芦苇和白鹤芋对NH3-N的去除效果，认为在相同水力停留时间条件下，植物对NH3-N去除率无显著影响；而Carballeira等[23]研究表明，与不种植物相比，种植植物能够提高70%的氮去除率. 人工湿地植物脱氮研究结果差异可能归咎于植物对人工湿地的影响较复杂，其对脱氮效率的影响主要表现在2个方面：①植物对污染物的直接吸收作用. 对人工湿地植物不同种植密度的研究[24]发现，高密度(20株/m2)与低密度(10株/m2)处理的污水净化效果和微生物群落组成无显著差异，但种植植物的水质净化效果和微生物丰度均显著高于不种植物的对照；也有研究[6]认为，植物吸收的氮主要储存在地下部，若在植物不收割的情况下，植物的吸收对氮去除的贡献不大. 该研究中种植的植物为多年生芦苇和香蒲，均未进行收割，因此植物的吸收作用对氮去除的影响可能较小. ②植物根际效应重塑了微生物群落结构，微生物活性增加，实现微生物对氮的转化，提高脱氮效率. WANG等[25]对潜流型人工湿地处理低浓度生活污水的研究表明，在夏季种植植物和不种植物处理的微生物群落结构无显著差异，而冬季则存在显著差异，因此在不同温度条件下，植物可能通过对微生物的间接影响提高脱氮效率. 硝化和反硝化过程作为人工湿地主要脱氮途径，其脱氮效率也会受到植物根际影响. 植物根系泌氧导致根际周围存在好氧、缺氧和厌氧环境，为多种微生物提供适宜生境，促进了多种微生物共同协作，并在脱氮中发挥作用. 硝化作用是氮循环的关键步骤，在低氧条件下，该过程会成为人工湿地脱氮的限速步骤. Paranychianakis等[26]认为，湿地植物通过释放氧气提高脱氮效率，植物根系泌氧促进了根际好氧的氨氧化菌繁殖及其活性的提高，有利于硝化作用对NH3-N的去除，氨氧化古菌在NH3氧化中起重要的作用，且在不同植物间无显著差异. 当人工湿地中各种形态的氮转化成稳定态的NO3-后，可以通过反硝化作用将其转化成N2，反硝化菌大多为异养，植物根系分泌物中含有的低分子量有机酸(如乙酸、草酸和琥珀酸等)、糖、氨基酸和次级代谢产物可以为其提供碳源，促进反硝化菌繁殖和活性提高，从而提高反硝化作用对硝态氮的去除率[9]. WU等[27]研究表明，反硝化菌受根系分泌物浓度的影响，如蔗糖显著影响根际编码nirS蛋白的反硝化菌群落结构，蔗糖和草酸显著影响根际编码nirK蛋白的反硝化菌群落结构. 然而，该研究未对硝化和反硝化活性及功能微生物进行分析，在后期研究中应采用同位素技术深入研究种植植物对硝化和反硝化速率以及功能微生物的影响，阐明人工湿地植物对脱氮的间接生态效应.

3.2 不同植物对微生物群落功能多样性的影响

AWCD值变化速率的差异可以反映不同处理土壤微生物的代谢活性差异，AWCD值增加越快，表明微生物的代谢活性越高. 该研究中种植植物的根际土壤微生物的AWCD值均高于不种植物的对照，可能是根际环境对土壤微生物具有较大的影响. 研究[28]表明，植物光合作用固定的碳有5%～25%会以根系分泌物的形式释放到土壤中，根系分泌物在根际微生物分布、生长和繁殖中发挥着重要作用，湿地植物根际有机碳释放速率、根系分泌物类型或数量均会影响根系周围微生物丰度和活性. 该研究中根际土壤微生物的丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数均高于对照，说明种植植物促进了微生物物种多样性，除了根际碳沉积作用外，植物根系泌氧也会对土壤微生物碳源代谢活性产生影响[29]，植物氧释放可以改变氧化还原电位和促进微生物活性[30]，氧气释放量与总氮的去除率存在正相关关系[31]. WANG等[32]对比了种植植物、植物收割和不种植物三种处理，发现种植植物能够增加氧释放、促进铵态氮的去除、显著增加微生物丰度. WANG等[33]采用13C-PLFA 技术研究了种植植物对土壤微生物的影响，发现与不种植物的空白对照相比，种植植物的土壤微生物量显著增加，土壤微生物群落结构发生了改变，真菌和革兰氏阴性菌相对比例增加. 该研究中空白对照的土壤微生物对碳水化合物、氨基酸、羧酸和酮酸类碳源的相对利用率均低于种植植物的根际土壤，而对聚合物和胺类的相对利用率均高于种植植物的根际土壤，不同处理间对碳源相对利用率的差异也归咎于植物根际环境对微生物群落组分的改变，然而Biolog技术只能从整体上反映微生物活性的变化，无法准确分析碳源利用率与脱氮效率的关系，因此后期工作中需进一步研究植物对氮转化功能微生物群落结构的影响.

该研究中对96 h的AWCD值进行PCA分析，结果表明种植植物与不种植物存在显著差异，而种植芦苇和香蒲对土壤微生物碳源利用的差异不显著. 研究[34]发现，植物根系泌氧量和植物根系分泌物组成受营养物质组分、温度和光照等环境条件的影响，并且根系泌氧量和根系分泌物需达到一定浓度才对微生物产生作用，因此该研究中不同植物对土壤微生物碳源代谢不显著的原因，可能是芦苇和香蒲的生长条件相似且根系泌氧量和根系分泌物浓度差异较小，不足以对微生物整体活性产生显著差异. 因此，在后期研究中需要对芦苇和香蒲根系泌氧状况及根系分泌物总量和种类进行分析，还需对植物根系泌氧和根系分泌物与微生物群落组分和氮转化功能微生物相关性进行分析，以期阐明植物对水平潜流型人工湿地氮去除的作用机制.

4 结论

a) 水平潜流型人工湿地种植芦苇和香蒲均可提高NH3-N去除率，其出水中NH3-N去除率较对照高7%～33%.

b) 芦苇和香蒲根际土壤的w(DOC)和w(NH4+)均显著高于对照土壤.

c) 在水平潜流型人工湿地种植芦苇和香蒲改变了土壤微生物碳源利用率和碳源利用类型. 芦苇和香蒲的根际土壤微生物碳源利用率增加速度均显著高于对照. 芦苇和香蒲的根际土壤微生物均对碳水化合物的相对利用率最高，均在48.0%以上，而对照土壤微生物对碳水化合物和聚合物的相对利用率较高，分别为34.4%和32.7%.

d) 水平潜流型人工湿地种植芦苇和香蒲改变了土壤微生物的多样性. 芦苇和香蒲根际土壤微生物的丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数和Shannon-Wiener均匀度指数均显著高于对照土壤，而芦苇和香蒲根际土壤的微生物群落组成无显著差异.