基于油提取的土壤与沉积物中微塑料的分离方法

董明潭，罗泽娇，邢新丽，张俏俏，孙 越

1.中国地质大学(武汉)环境学院，湖北 武汉 430078 2.中国地质大学(武汉)李四光学院，湖北 武汉 430074

微塑料一词首先由Thompson等[1]提出，是指环境中粒径小于5 mm的塑料类污染物，有碎片状、纤维状、颗粒状、发泡状、薄膜状等不同形貌形态. 按照微塑料来源可以分为初级微塑料(商品中使用的塑料磨料、微珠等，如牙膏、洗面奶)与次级微塑料(由较大碎片进一步风化而来). 相较于较大的塑料而言，微塑料具有较小的粒径、较大的比表面积等特点，被证实可随大气[2]、洋流[3-4]等方式进行远距离传输，通过摄食作用进入生物体内并经食物链富集[5-7]，对重金属与持久性有机污染物具有一定的吸附能力[8-11]. 这使得微塑料成为一种全球性新兴污染物，并受到了广泛关注.

目前关于微塑料的研究主要集中在滨海-海洋环境中，陆地生态系统作为微塑料的“源”在研究中往往被忽视，关于土壤与湖泊沉积物中微塑料的相关报道很少[12]，对于其中微塑料的污染特征、环境行为、生物效应等也不是很清楚[13-14]. 因此，土壤与沉积物基质中微塑料的分离提取作为该领域的关键与基础工作，应该予以高度重视[15]. 但受土壤与沉积物基质复杂性的影响，尚缺乏一种经济、可靠、快速的手段将其从土壤与沉积物中分离出来，以便开展进一步系统研究[16]. 现有研究中多使用不同密度的盐溶液进行浮选，最常见的为饱和NaCl溶液(1.19 g/cm3)[17-20]，但该溶液对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚氯乙烯(PVC)等高密度聚合物的提取效果较差. LIU等[18]使用该方法在上海市开展的农田微塑料研究中没有观察到PVC与PET；也有研究使用更高密度的ZnCl2[21]或者饱和NaI[22]溶液进行浮选，但这些盐溶液较为昂贵且对环境有害.

Crichton等[23]于2017年提出油提取方案(oil extraction protocol，OEP)，利用塑料的亲油(脂)性，使用植物油代替密度液分离微塑料，针对滨海砂质沉积物获得了高回收率(96.1%±7.4%)与较快的样品处理速度(90～168 min/样)，且经过醇处理后兼容傅里叶红外光谱(FT-IR)检测. 该方法提出两年来共被引24次(Web of Science，截至2019年9月25日)，但并未有学者对其开展试验验证. 鉴于此，该研究对油提取法在不同质地土壤与黏粒湖泊沉积物中的适用性进行系统研究，对提取步骤进行优化与调整，以尽可能减少样品或溶液转移过程中的微塑料丢失问题，并使用所采集的不同质地土壤与湖泊沉积物对其开展了实地验证，以期为未来土壤与沉积物中微塑料的检测与监测工作提供参考.

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

土壤样品使用铁锹铲取至玻璃罐中保存，采集表层(0～5 cm)样品混合均匀. 砂土样品采集于湖北省黄冈市罗田县二长花岗岩风化层残坡积物(30°46′11.80″N、115°22′21.65″E)；壤土采集于湖北省武汉市江夏区菜地黄棕壤(30°23′28.95″N、114°27′17.81″E)；黏土采集于湖北省武汉市江夏区水稻田水稻土(30°12′26.99″N、114°01′34.22″E). 湖泊沉积物使用活塞式柱状沉积物采样器采集，采样点位于湖北省武汉市东湖(30°32′57.58″N、114°21′51.27″E)，采样深度为0～5 cm，采样时保证对表层沉积物无扰动.

土壤样品采集后于105 ℃下烘干至恒质量，烘干后过18目(1 mm)筛以去除较大的石块，在室温下保存备用. 对于湖泊沉积物样品，为避免烘干后固结、研磨对微塑料的破坏，采用混合均匀后的湿沉积物进行微塑料提取与检测，同时测定沉积物的含水量，定量分析时换算为干质量. 湖泊沉积物采集后不做处理，于4 ℃下保存备用.

1.2 标准微塑料制备

购买聚氯乙烯(PVC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)这4种使用广泛的塑料商品，分别代表密度较高(PVC，1.38 g/cm3；PET，1.37 g/cm3)与密度较低(PP，0.83～0.84 g/cm3；PS，1.05 g/cm3)的塑料. 使用粉碎机将其粉碎，过筛得35～60目(0.25～0.5 mm)大小的不规则塑料颗粒，制成标准品(见图1). 所制备的微塑料具有独特的大小与形状，可与实际样品中可能存在的微塑料相区别. 每种塑料具有不同的颜色以方便计数并计算回收率.

1.3 油提取方法

称取10 g(干质量)土壤或15～20 g(湿质量)沉积物置于250 mL锥形瓶中，向其中加入每类微塑料标准品各10个，共计40个. 向锥形瓶中加入约5 mL油(玉米胚芽油，长寿花)与100 mL过滤水(经过1 μm孔径微孔滤膜预先过滤的自来水)，手动振荡约30 s使油与微塑料充分接触. 振荡结束的标志是土壤与沉积物完全分散，无成团块体，必要时可使用搅拌棒或磁力搅拌器. 静置沉降15～30 min后将倒入配备有微孔滤膜(尼龙，孔径20 μm，直径47 mm，海盐塑化科技有限公司)的过滤装置上抽滤0.5～1 min. 上述步骤重复3次. 使用无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)冲洗过滤器与微孔滤膜，每次加入5 mL，浸泡约1 min后抽滤，重复2次. 在试验过程中，使用过滤水冲洗锥形瓶瓶壁与过滤杯杯壁，以尽可能避免微塑料黏附在瓶壁上. 最后将滤膜取下转移至保存盒中保存，在连续变倍体视显微镜(XTL165-MT, 凤凰光学股份有限公司)下观察、计数并计算回收率. 处理过程见图2.

为了探究不同溶液浮选对微塑料回收率的影响，分别使用5 mL油和100 mL水(简称“油提取”)、5 mL油和100 mL饱和NaCl溶液(简称“NaCl-Oil联合提取”)、100 mL饱和NaCl溶液(简称“NaCl浮选”)的组合进行试验. 每组进行3次，共进行12组合计36次回收率试验. 计算每组3次试验所得回收率的平均值与标准偏差.

为验证该方法在环境样品中的可靠性，另称取所采集的不同质地自然土样10 g(干质量)与沉积物样15～20 g(湿质量)各1份，不加入塑料标准品，进行油提取. 在体式显微镜下以50倍观察大于100 μm的微塑料，计数并记录其大小与颜色.

1.4 拉曼光谱分析

使用配备有532与633 nm激光的显微共聚焦拉曼光谱仪(LabRAM HR Evolution, HORIBA，日本)逐个对微塑料进行鉴定. 光谱采集范围为300～3 300 cm-1，采集时间10 s，累计2次. 使用0.1%～5%(通常为1%)功率衰减片以避免烧穿样品. 对于每个样品，选择不同部位并通过快速切换器切换532与633 nm激光以避免荧光干扰，重复测量3次以获得质量足够好的光谱.

由于所用显微共聚焦拉曼光谱仪没有配备光谱数据库，故预先收集各种常见类型的塑料并使用显微共聚焦拉曼光谱仪在相同条件下收集光谱以建立标准光谱库，共获得8种聚合物类型合计19张光谱. 将实际样品中微塑料的光谱与标准光谱进行比对以确定聚合物类型. 拉曼光谱分析在中国地质大学(武汉)地质过程与矿产资源国家重点实验室完成.

1.5 质量控制与质量保证

取样与试验过程中，除湖泊沉积物取样器为PMMA塑料材质外，其余均使用玻璃制品. 试验人员穿着棉质而非化纤衣服. 锥形瓶等使用铝箔纸覆盖以避免空气中可能的微塑料进入容器中. 试验使用的油与水均预先通过1 μm微孔滤膜(尼龙，孔径1 μm，直径47 mm，海盐塑化科技有限公司)过滤以去除可能存在的微塑料. 微塑料目视计数由两名经验丰富的试验人员共同完成，以最大可能提高目视鉴定精度. 在利用该方法开展实地研究时，设置了3组空白对照，除不加入土样外，其余操作均保持一致，以监控实验室大气中可能存在的微塑料污染，但均未观察到.

2 结果与分析

2.1 微塑料回收率

分析结果显示，单独使用油提取时，砂土、壤土、黏土、湖泊沉积物中微塑料的回收率(见表1)分别为88.3%±6.29%、88.3%±3.82%、90.0%±2.50%、90.8%±1.44%；而使用NaCl-Oil联合提取时的回收率分别为89.2%±10.4%、94.2%±1.44%、95.0%±2.50%、97.5%±4.33%，相比单独使用油提取时回收率明显上升；单独使用NaCl浮选时，微塑料的回收率分别仅为41.7%±14.7%、25.8%±7.64%、37.5%±4.33%、16.7%±16.1%，远低于使用油进行提取时的回收率.

无论是单独使用油提取还是NaCl-Oil联合提取，微塑料回收率均表现为湖泊沉积物>黏土>壤土>砂土. 在单独使用NaCl浮选时，针对PVC与PET两种密度较高的聚合物回收率很低；针对PP、PS两种密度较低的塑料回收率也仅为50%左右. 在壤土中，单独使用油提取时，针对密度较高的PVC与PET，分别取得了93.3%±11.6%与96.7%±5.77%的高回收率.

表1 不同介质中微塑料回收率

图3 未处理微塑料与经油提取后微塑料的拉曼光谱图Fig.3 Raman spectra of untreated microplastics and extracted microplastics

2.2 与拉曼光谱的兼容性

Crichton等[23]研究发现，油的加入会在FT-IR光谱图上出现新的峰. 但该研究得到的拉曼光谱表征结果(见图3)显示，油的加入并没有带来新的峰，却掩盖了PS塑料峰值信号的强度，降低了信噪比，具有较强的背景干扰. 即使通过Origin非对称最小二乘平滑算法去除基线后，仍只能观察到PS在 1 000、1 030、2 903、3 051 cm-1处的4个信号最强的峰，其余位置(621、796、1 602 cm-1)的峰很难确认. 在经过乙醇冲洗后，Raman光谱图与未经油提取前基本一致，表明使用无水乙醇冲洗可以较好地去油，从而避免对微塑料拉曼光谱表征的影响.

2.3 提取效果对比

油提取过程中，振荡结束静置10 min后，对比单独油提取与NaCl-Oil联合提取的静置沉降效果(见图4). 结果显示，使用NaCl-Oil联合提取的沉降效果优于单独使用油提取，缩短了静置时间并获得了更快的样品处理速度. 但是，使用NaCl-Oil联合提取时滤膜上的其他物质明显增多(见图5)，加大了过滤的难度，也对微塑料的显微镜检造成了干扰，需要在提取后通过使用30%的H2O2消解处理等进一步的净化手段予以去除.

注：对于每种供试土样，左为油提取，右为NaCl-Oil联合提取.图4 油提取法与NaCl-Oil联合提取法静置沉降效果对比Fig.4 Comparison of static settling effect between oil extraction protocol and NaCl-Oil combined extraction protocol

注：对于每种供试土样，左为油提取，右为NaCl-Oil联合提取.图5 油提取法与NaCl-Oil联合提取法提取结果对比Fig.5 Comparison of extraction results between oil extraction protocol and NaCl-Oil combined extraction protocol

2.4 微塑料污染特征

由图6可见，供试残坡积物(砂土)、菜地(壤土)、水稻田(黏土)和湖泊沉积物中微塑料丰度分别为19个/(11.194 4 g)、17个/(10.544 7 g)、20个/(11.326 9 g)和31个/(4.063 3 g)(均以干质量计，其中湖泊沉积物样品通过测量含水量换算). 残坡积物(砂土)中微塑料丰度为 1 697 个/kg，以蓝色为主，占77.8%，其余则为无色(11.1%)与红色(11.1%)；形态以纤维状(66.7%)与碎片状(33.3%)为主，平均长度为1 497 μm，长度为100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分别为0、44.4%、44.4%、11.1%；聚合物成分主要为聚乙烯(PE)、人造丝(Rayon)、PVC，三者占比均为22.2%.

图6 土壤与沉积物中微塑料丰度、颜色、长度与聚合物种类Fig.6 The abundance, color, length, and polymer type of microplastics in soils and sediments

菜地(壤土)中微塑料丰度为 1 612个/kg，以无色(50.0%)与蓝色(35.7%)为主，纤维状占78.6%，碎片状占21.4%；平均长度为1 351 μm，长度为100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分别为14.3%、28.6%、50.0%、7.14%；聚合物成分主要为PE、PVC、Rayon，占比分别为30.7%、23.1%、15.4%.

水稻田(黏土)微塑料丰度为1 766个/kg，以无色(75.0%)与蓝色(20.0%)为主，纤维状占55.5%，碎片状占25.0%；平均长度为 1 119 μm，长度为100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分别为25.0%、35.0%、40.0%、0；聚合物成分主要为PE、PET、PVC、Rayon，占比分别为26.3%、21.1%、21.1%、15.8%.

湖泊沉积物中微塑料丰度为 7 624个/kg，微塑料的形态以纤维状与长条状碎片为主，颜色为蓝色(60.7%)、无色(32.1%)与红色(7.14%). 平均长度为 1 317 μm，长度为100～500、500～1 000、1 000～3 000、3 000～5 000 μm的比例分别为14.3%、32.1%、46.4%、7.14%；聚合物成分主要为PET、PVC、Rayon，占比分别为26.7%、20.0%、16.7%，其他聚合物成分主要为聚酰胺PA(13.3%)、PE(10.0%)、PP(10.0%).

综上，该研究中湖泊沉积物中微塑料丰度显著高于土壤中微塑料丰度，不同质地土壤中微塑料丰度之间均无显著差别；微塑料形态均以纤维状或长条状碎片为主，缺少球状与颗粒状，平均长度主要集中在500～3 000 μm之间；Rayon、PET、PVC、PE是最主要的聚合物成分.

3 讨论

3.1 转移过程与H2O2净化对回收率的影响

Crichton等[23]在油提取步骤中，首先将锥形瓶中的油层与水层倒入分液漏斗中，在分液漏斗中再次静置后再倾倒至过滤装置中进行过滤，实现梯次静置以尽可能减少进入滤膜上其他物质(悬浮颗粒物、细小的植物体等)的丰度. 但在上述过程中溶液转移2次，增加了微塑料丢失的可能. 为尽可能减少溶液转移次数以减少微塑料丢失的可能性，可直接将锥形瓶中上清液倒入过滤装置中.

油提取法利用塑料的亲油性将塑料聚集在溶液表层的油层中，同时溶液中仍含有悬浮颗粒物、细小的植物体等杂质，直接倾倒相比梯次静置可能会导致更多的杂质进入滤膜，增大了滤膜堵塞的可能性. 离心操作在密度浮选法中常被用来减少进入到滤膜上的杂质[24]，但不能够应用于油提取中，这会使微塑料回到土壤或沉积物中并降低回收率. 该研究将Crichton等[23]方案中的静置时间从3～5 min延至15～40 min，通过延长静置时间达到减少杂质的目的，在应用中可根据需要进一步延长. 此外，还可以在每次倾倒后更换滤膜，将一个样品过滤至3个不同的滤膜上，以预防滤膜堵塞.

NaCl-Oil联合提取可将微塑料的回收率提至95%以上，同时加快了沉降速率，减少沉降时间，但也增加了进入滤膜上的杂质含量(见图5)，加大了显微镜检的难度. 在使用密度浮选法时，常在浮选之前使用30%的H2O2进行净化. 而在使用油提取法时，Crichton等[23]研究表明，在提取之前进行H2O2净化处理会降低回收率. 该研究在壤土中进行油提取时，同样发现在提取之前进行H2O2净化时，微塑料回收率从88.3%±3.82%降至36.7%±13.8%，与Crichton等[23]的结论一致. 在油提取后进行H2O2净化处理则不会对微塑料回收率造成显著影响，但会延长样品处理时间.

3.2 样品质量要求

将该研究与国内近期其他研究所得数据进行对比(见表2)发现，不同研究者所得土壤中微塑料丰度存在数量级的差距. 由于各研究所采用的提取方法不同，导致数据之间的可比性较差. 大部分研究没有给出具体的样品量，笔者使用约10 g土壤样品进行微塑料的浮选，获得微塑料约20个，足够进行微塑料的目视鉴定与光谱表征；Mathalon等[27]使用10 g的样品也观察到了20～80个微塑料. 在使用更大的样品质量进行微塑料提取时，不仅会增加前处理过程的难度，延长处理时间并可能堵塞滤膜，也不太可能将得到的所有微塑料逐个进行光谱表征. 因此，笔者建议，在能够获取到约20个微塑料时，使用10 g左右的小样品质量进行微塑料提取是可行的. 在未来的研究中也应该注意样品质量对所得微塑料丰度的影响.

表2 不同研究中土壤微塑料提取方法与微塑料特征对比

注：—表示无数据.

3.3 微塑料形态特点与聚合物种类

该研究所选不同质地土壤中纤维状与长条状碎片是最主要的微塑料形态. 大量实地研究[22,27-31]也表明，纤维状是最常见的微塑料形态，但回收率研究中使用的标准品却是不规则颗粒状微塑料. 因此，如何制备并投放纤维状微塑料标准品是今后方法学研究工作的一个难点. 纤维状微塑料长度为 2 000～5 000 μm，但其宽度只有5～15 μm. 显微红外光谱仪最小检测直径通常为20 μm，无法满足纤维状微塑料的检测要求[15]. 因此，在鉴定纤维状微塑料时，推荐使用显微拉曼光谱进行表征.

武汉市东湖沉积物中微塑料丰度为 7 624个/kg，高于YUAN等[27]在鄱阳湖沉积物中测得的54～506个/kg，除了不同提取方法对微塑料丰度的影响外，可能也与武汉市东湖作为我国最大的城中湖，其周围人类活动频繁有关. 有研究表明，洗涤期间每套成人衣服可以减少约 1 900 根PET[32]，而武汉市东湖沉积物中微塑料主要类型为PET与Rayon，且主要形态为纤维状，说明纺织品洗涤可能是微塑料的重要来源之一.

相比于其他研究(见表2)而言，该研究在土壤中检出PP与PE的基础上，更多地检出了PET与PVC这两种密度较高的微塑料. PET与PVC是在使用饱和NaCl提取时很难被检出的，以往的研究中可能忽视了环境中存在的PET与PVC微塑料.

4 结论

a) 油提取法针对常见种类的微塑料均具有良好的回收率，是当下密度浮选技术的可替代方案，具有高回收率、经济、快速、可靠的特点.

b) 油提取法针对高密度聚合物(PVC、PET)仍然具有较高的回收率(>90%)，在不同质地土壤与沉积物中均可使用，具有广泛的适用性.

c) 油提取法具有较快的样品处理速度，根据样品质地不同，60～120 min内即可处理一个样品. 处理后的杂质较少，便于在显微镜下进行观察与计数.

d) 油的加入会干扰FT-IR与Raman光谱表征，但可使用无水乙醇冲洗去除，具有良好的兼容性.