霜冻前后野生余甘子果实功能成分的变化

赵琼玲，张永辉，罗会英，金 杰，何 璐，袁建民， 瞿文林，沙毓沧

（1.云南省农业科学院 a.热区生态农业研究所，云南 元谋 651300；b.园艺作物研究所，云南 昆明 650001； 2.元谋干热河谷植物园，云南 元谋 651300）

余甘子Phyllanthus emblica为大戟科叶下珠属植物，又名滇橄榄，其果实入口苦涩，回味甘甜，故名“余甘”。余甘子果实性凉，味甘，酸涩，具有清热凉血、消食健胃、生津止渴的功效。临床医学研究结果证明，余甘子果实具有抗肿瘤，抗衰老[1]，抗病原微生物，降血脂和血压，促使排铅，治疗糖尿病，控制和治疗胆道疾病[2]，消炎消毒，止泻止痛，治疗血热血淤、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛、口干[3]的作用，是卫生部审核颁布的“药食同源”植物[4]。

余甘子果实富含酚酸类化合物（没食子酸、单宁）[5]、黄酮[6]、多糖、维生素C、SOD、氨基酸等成分，营养丰富。目前，余甘子果实营养成分的形成及积累变化机制已成为种质资源学及药食同源植物研究的热点。经研究发现，余甘子果实营养成分的形成及积累变化与来源地有关。陈晓兰等[7]比较了不同产地余甘子果实的多糖含量，发现广州余甘子果汁中多糖含量最高；赵琼玲等[8]对余甘子成熟果实氨基酸组成进行分析，发现不同来源的余甘子果实的氨基酸组成和含量有较大差异。另一方面，余甘子果实营养成分的形成及积累变化与其成熟过称有关。陈贵清等[9]观测同一余甘子植株果实成熟过程中内含物变化，发现维生素C 和糖含量在翌年3月上旬达最大值，有机酸含量在翌年1月呈下降趋势，单宁含量变化规律不明显，纤维素含量在整个果实成熟期变化不大；赵虹等[10]对同一地点3 株余甘子植株不同成熟期果实主要成分进行研究，发现维生素C 和SOD 含量在每年11月初至翌年2月初含量最高，总糖含量在翌年2月后达最高。从以上研究结果来看，余甘子果实营养成分的形成在较大程度上受到种质区位和植株生长发育时间的影响。区位和植株生长发育的差异，很大程度上是对区域气候差异的响应，李昆等[11]进行了不同省份余甘子果实形态和营养成分分析，认为气温有可能是影响余甘子果实营养成分积累的主要因素。在生产实践中，立秋后余甘子果实进入成熟期，大量鲜果上市，而立冬后采收的果实更甘甜，味道更好。由于立秋至立冬期间普遍存在降温乃至霜冻情况，温度的变化，特别是低温过程可能对余甘子果实风味和营养物质产生了影响，但目前鲜见立秋至立冬后降温过程对余甘子果实主要营养物质含量变化影响的相关研究报道。

云南永仁素有“太阳城”之称，光照充足，立秋后该区域余甘子果实普遍成熟，当地有降温霜冻后采收余甘子果实的习俗，是研究降温后余甘子果实营养物质的变化和特色余甘子种质风味形成的较好的试验场所。本研究中以立秋、立冬2 个节气为观测时间点，采集永仁同一地点同一居群的野生余甘子果实，对其蛋白质含量、SOD 活性、氨基酸含量、维生素C 含量、总糖含量、总酸含量、总酚含量、硒含量进行测定和比较，明确以霜冻为特征的降温过程中余甘子果实营养物质的积累及变化特征，以期为余甘子果实风味形成机制的研究提供数据，为余甘子果实的采收和加工利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

云南楚雄州永仁县位于东经101°14′—101°49′，北纬25°51′—26°30′，年均日照达2 824.4 h，年均气温17.8 ℃，年均降水量840 mm。取样地点为永仁县的野生余甘子林，选取同一居群生长状况基本一致的7 株代表性植株（YR01、YR02、YR03、YR05、YR06、YR07、YR08）作为研究样本进行采样观测。2018年，在果实成熟时进行第1 次采果（立秋，8月），霜冻后进行第2 次采果（立冬，10月）。2018年永仁地区全年气温变化情况如图1 所示，8月后最高温值及最低温值均出现明显下降，10月明显出现霜降气候，其中4月为余甘子果实初果期，5月至立秋前为果实膨大期，立秋后为果实成熟期。

图1 2018年云南永仁县各月平均气温的变化Fig.1 Mean monthly temperature changes of Yongren county of Yunnan in 2018

1.2 测定项目和测定方法

采用随机抽样的方法，按每株树冠外层东西南北4 个方向的上中下位置摘取果实。从所摘果实中随机选取10 个果实，利用游标卡尺测定果实横纵径、果肉厚，用电子天平（精度为0.001）测定单果质量、果核质量，取平均值。取果肉进行室温匀浆，各称取0.1 g，待测。

采用微量法测定维生素C 的氧化速率，计算维生素C 含量；采用微量法测定蛋白质含量；使用紫外分光光度计测定570 nm 处吸光值，计算氨基酸含量；用超声提取法进行提取，使用分光光度计/酶标仪预热30 min，测定760 nm 处吸光值，计算总酚含量；用蒽酮比色法测定总糖含量。

1.3 数据处理

使用Office Excel 2003 软件整理数据，使用SAS 软件进行单因素方差分析及指标间相关性统计分析。

2 结果与分析

2.1 霜冻前余甘子果实形态和功能成分

2.1.1 霜冻前果实形态和功能成分指标

霜冻前（立秋）余甘子果实的形态及功能成分含量或活性见表1。由表1 可知，霜冻前余甘子YR05 样株的果实横径显著大于YR06、YR07样株，与其他样株差异不显著（P＞0.05）；YR07 样株果实纵径显著大于YR01、YR05 样株，与其他样株差异不显著（P＞0.05）；YR05 样株单果质量显著高于YR06、YR07 样株，与其他样株差异不显著（P＞0.05）；YR06 样株果肉厚显著大于YR03、YR05、YR08 样株（P＜ 0.05）；YR02 样株果核质量显著大于YR05 样株（P＜0.05）。

果实化学成分分析结果显示，霜冻前余甘子果实蛋白质含量平均值为294.85 mg/g，YR02 样株果实蛋白质含量最高，YR01 样株含量最低，YR02 和YR05 样株果实蛋白质含量极显著高于YR01、YR03、YR06、YR07、YR08 样株（P＜0.01），变异系数为25.31。YR06 样株果实的SOD 活性最高，为356.29 U/g，YR02 样株最低，为242.08 U/g。果实SOD 活性平均值为297.38 U/g，高于均值的样株有YR01、YR03、YR06、YR07，其中YR06样株极显著高于其他样株（P＜0.01）。果实氨基酸含量平均值为28.06 μmol/g，含量最高为YR06样株，最低为YR05 样株，YR06 样株果实氨基酸含量极显著高于其他样株（P＜0.01）。果实维生素C 含量平均值为1 084.8 nmol/g，最高为YR01样株，其含量为1 739.12 nmol/g，最低为YR02样株，其含量为817.42 nmol/g，YR01 样株果实维生素C含量极显著高于其他样株（P＜0.01）。果实总糖含量平均值为48.13 mg/g，含量最高为YR02 样株，含量最低为YR01 样株，YR02 样株果实总糖含量与YR05 样株差异不显著（P＞0.05），与其他样株差异极显著（P＜0.01）。果实总酸含量平均值为4.28%，最高为YR02 样株，最低为YR05 样株，YR02 样株果实总酸含量极显著高于其他样株 （P＜0.01）。果实总酚含量平均值为22.88 mg/g，最高为YR02 样株，最低为YR01 样株，YR02 样株果实总酚含量与YR05、YR08 样株差异不显著 （P＞0.05）。果实硒含量平均值为51.08 µg/kg，最高为YR03 样株，最低为YR08 样株，YR03 样株果实硒含量极显著高于其他样株（P＜0.01）。所测指标中变异系数最大的是硒含量，其次为单果质量、氨基酸含量、维生素C 含量。

2.1.2 霜冻前果实形态和功能成分指标间的相关性

霜冻前余甘子果实各指标间的相关性见表2。由表2 可知，单果质量与果肉厚、果实横径呈极显著相关（P＜0.01），与果实纵径呈显著相关 （P＜0.05）；果肉厚与果实横径呈极显著相关（P＜ 0.01）；果实蛋白质含量与维生素C 含量呈极显著负相关（P＜0.01），与果实总糖含量、总酚含量极显著相关（P＜0.01）；果实维生素C 含量与总酚含量呈极显著负相关（P＜0.01）；单果质量、果实横径与果实SOD 活性呈显著相关；果肉厚与果实硒含量呈显著相关（P＜0.05）。

表1 霜冻前余甘子果实的形态及功能成分含量或活性†Table 1 Morphology and contents or activity of functional components in P.emblica fruits before frost

表2 霜冻前余甘子果实各指标间相关性†Table 2 Correlation between indexes in P.emblica fruits before frost

2.2 霜冻后余甘子果实形态和功能成分

2.2.1 霜冻后果实形态和功能成分指标

霜冻后（立冬）余甘子果实的形态及功能成分含量或活性见表3。由表3 可知，YR05 样株的果实横径显著大于YR01、YR02、YR06、YR07、YR08 样 株（P＜0.05），YR08样株的果实纵径显著大于其他样株（P＜0.05）；YR08样株单果质量显著高于YR01、YR02、YR03、YR07 样株（P＜0.05）；YR05 样株果肉厚显著大 于YR01、YR02、YR05、YR07、YR08 样株（P＜0.05）；YR06 样株果核质量显著大于其他样株（P＜0.05）。

表3 霜冻后余甘子果实的形态及功能成分含量或活性Table 3 Morphology and contents or activity of functional components in P.emblica fruits after frost

果实化学成分分析结果显示，余甘子果实蛋白质含量平均值为329.93 mg/g，高于均值的样株有YR02、YR05、YR06、YR07，其中YR05 样株果实蛋白质含量极显著高于其他样株（P＜0.01）。YR01 样株果实SOD 活性最高，为316.86 U/g， YR02样株最低， 为237.54 U/g， 平均值为 269.23 U/g，高于均值的样株有YR01、YR07、YR08，其中YR01 样株果实SOD 活性极显著高于YR02、YR03、YR05、YR06、YR07 样株（P＜0.01）。果实氨基酸含量平均值为36.97 μmol/g，含量最高为YR06 样株，最低为YR08 样株，YR06 样株果实氨基酸含量极显著高于其他样株（P＜0.01）。果实维生素C 含量平均值为1 074.53 nmol/g，YR06 样株最高，含量为1 059.89 nmol/g，YR02样株含量最低，为643.43 nmol/g，YR01 样株果实氨基酸含量极显著高于其他样株（P＜0.01）。果实总糖含量平均值为52.97 mg/g，含量最高为YR02 样株，含量最低为YR08 样株。果实总酸含量平均值为3.71%，最高为YR08 样株，最低为YR02 样株。果实平均总酚含量为23.00 mg/g，最高为YR02 样株，最低为YR03 样株。果实硒含量平均值为19.26 μg/kg，最高为YR03 样株，最低为YR06 样株，YR03 样株果实硒含量极显著高于其他样株（P＜0.01）。所测指标中，变异系数最大的为氨基酸含量，其次为硒含量。

2.2.2 霜冻后果实形态和功能成分指标间的相关性

霜冻后余甘子果实各指标间的相关性见表4。由表4 可知，果肉厚与果实横径呈极显著相关 （P＜0.01）；单果质量与果实横径呈显著相关（P＜ 0.05）；果核质量与果实纵径呈显著相关（P＜ 0.05）；果实维生素C 含量与总糖含量呈极显著负相关（P＜0.01），与总酸含量显著相关（P＜ 0.05）；果实总糖含量与总酸含量呈极显著负相关（P＜0.01）；果实纵径与总酸含量呈显著相关 （P＜0.05）。

2.3 霜冻前后余甘子果实功能成分的变化

通过比较表1 和表3 中数据可知，霜冻前后余甘子果实的功能成分的含量或活性发生了显著变化。霜冻后，果实蛋白质、氨基酸、总糖、总酚含量均增加。其中，氨基酸含量由28.06 μmol/g增大到36.97 μmol/g；总糖含量由48.13 mg/g 增加到52.97 mg/g；蛋白质含量由294.85 mg/g 增大到329.93 mg/g，增幅最大；总酚含量均值变化最小，由霜冻前的22.88 mg/g 变为23.00 mg/g。另一方面，霜冻后余甘子果实SOD 活性由297.38 U/g 降低到269.23 U/g；维生素C 含量由1 084.80 nmol/g 降低到887.82 nmol/g；总酸含量由4.28%降低到3.71%；硒元素含量由51.08 μg/kg 降低到19.26 μg/kg。结果表明，霜冻有改变余甘子果实营养物质形成或积累的作用。

表4 霜冻后余甘子果实各指标间的相关性Table 4 Correlation between indexes in P.emblica fruits after frost

3 结论与讨论

本研究结果表明，霜冻有改变余甘子果实营养物质形成或积累的作用。霜冻前，果实SOD活性、维生素C 含量、硒含量较高，可根据生产利用决定其采收期。单果质量、果实横径与果实SOD 活性呈显著相关，果肉厚与硒含量呈显著相关，在野外采果的时候可作为参考依据。霜冻后，果实蛋白质、氨基酸、总糖含量较高，这个阶段的果实口感较好。果实维生素C 含量与总糖含量呈极显著负相关，与总酸含量显著相关；总糖含量与总酸含量呈极显著负相关；果实的纵径与总酸含量呈显著相关。因此，瓜形果实的总酸含量较低，口感较好，这对野外资源收集有一定的参考作用。

气候对植物果实营养物质的形成和积累具有重要作用，其中温度是重要的指标之一。如年极端最高气温升高会降低油茶鲜果的含油量[12]。本研究结果表明，余甘子果实的横径、纵径、单果质量、果肉厚、果核质量等指标在霜冻前后存在显著差异，这一结果表明霜冻后余甘子果实生长模式发生了变化。同时，同一居群余甘子果实形态有不同程度的差异，这一结论与瞿文林等[13]认为余甘子果实表型性状在居群内存在着丰富的变异相吻合。霜冻后，余甘子果实的蛋白质、氨基酸、总糖和总酚含量增加，维生素C、硒和总酸含量减少，SOD 活性极显著降低，表明低温会导致余甘子果实化合物积累模式发生改变。郭兰萍等[14]认为植物化学表型形成的机制是遗传变异与环境饰变的共同作用。控制植物化学表型的功能基因存在于核基因中，核基因在居群间通过种子流和花粉流传递。余甘子为雌雄同株异花，种子传播范围有限，群体间地理间隔较大，不同居群间进行基因流的机会少[15]，而同一居群内基因交流多，这可能是导致本研究中余甘子果实化学类营养物质含量差异的又一重要原因。一般认为，SOD 活性降低表明果实体内清除自由基的能力减弱，此时果实体内代谢平衡受阻，膜系统功能及结构受到破坏[16-17]。本试验结果表明，霜冻后余甘子果实SOD 活性极显著降低，说明霜冻过程对余甘子果实的生长发育具有破坏性作用，但这种破坏作用对余甘子风味形成的作用尚不明了。此外，钟振国等[18]对我国不同产区余甘子果实的没食子酸含量进行测定，发现云南产区余甘子果实的没食子酸含量均高于其他地区。由于云南山地立体气候明显，相对多变的环境条件可能与这些次生代谢物的形成和积累关系密切。在后续的研究中，生物气候指标与余甘子没食子酸等特殊化合物的形成及积累间关系的研究应得到重视。

霜冻前余甘子果实蛋白质含量与维生素C、总糖、总酚含量极显著相关，霜冻后余甘子果实维生素C 含量与总糖含量极显著相关，总糖含量与总酸含量极显著负相关，这可能与低温对植物光合作用过程的影响有关。苏文华等[19]认为光合作用过多积累的碳，用于合成酚类等以碳为基础的次生代谢物质就会增多，含氮的次生代谢产物减少。低温对氮代谢有深刻影响，低温胁迫下，由于降解速率下降或合成加强，植物可溶性蛋白含量增加[16]。在正常情况下，植物体内游离氨基酸含量较低[20]，而在低温胁迫条件下，游离氨基酸含量迅速上升[21]，这可能是造成本研究中霜冻后余甘子果实氨基酸含量显著升高的原因。此外，霜冻后余甘子果实总糖含量显著高于霜冻前，而总酸含量显著低于霜冻前，且霜冻后余甘子果实总糖含量与总酸含量有极显著的相关性，表明霜冻可能会促进果实总酸向总糖的转变。硒对植物的生理功能有重要作用，参与蛋白质的合成，促进植物的生长代谢，增强植物体内的抗氧化能力[22]， 植物根系活力随着硒浓度的上升而增加，植物根系活力和叶绿素含量与硒浓度有关[23]。本试验结果表明，余甘子果实硒含量与SOD 活性、维生素C 含量、总酚含量等主要余甘子果实品质指标无相关性，而霜冻后余甘子果实硒含量减少，SOD 活性、维生素C 含量、总酸含量均减少，这些指标的变化是否与霜冻后余甘子叶片掉落，光合作用减少，根活力降低有关，其具体原因有待进一步研究。