HPLC法测定利咽饮中绿原酸的含量

马海平，许高新，王 曼，朱 军

(1.长江大学附属仙桃市第一人民医院 药学部，湖北 仙桃 433000；2.湖北医药学院附属东风医院 药学部，湖北 十堰 442000)

利咽饮是湖北省仙桃市第一人民医院的医院制剂，收载于《湖北省医院制剂规范(2011年版)》，是由金银花、玄参、连翘、桔梗、胖大海、蝉蜕、木蝴蝶、甘草、薄荷脑共9味药材提炼加工而成的中成药，具有滋阴清热、化痰利咽的功效[1]。利咽饮隶属医院制剂，当前其质量控制标准只有关于其中薄荷脑含量气相色谱法测定的相关报道[2]。而金银花作为方中主药，是利咽饮的主要有效成分之一，《湖北省医院制剂规范(2011年版)》中仅对绿原酸进行了薄层色谱鉴别，未对其含量进行控制。为确保利咽饮的疗效，本研究将对主药金银花的主要有效成分绿原酸进行含量测定。

金银花(LoniceraeJaponicaeFlos)是忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)的干燥花蕊或初开的花[3]，具有清热解毒、消痈散肿、抗菌消炎、免疫调节等作用[4]。金银花中含有多种有机酸类成分[5]，绿原酸(chlorogenic，CG)是其中药理活性最强的成分之一[6]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等药理作用[7]。现对金银花的有效成分绿原酸进行HPLC法含量测定，并预将绿原酸的含量作为控制利咽饮质量的主要指标。参考《中华人民共和国药典》2015年版一部中收载的金银花中绿原酸含量测定方法，调整流动相乙腈与0.4%磷酸的比例。当流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液9∶91时，利咽饮色谱图中各峰分离度良好，出峰时间适宜，峰形良好。

1 仪器与试药

1.1 仪器

P1201型高效液相色谱仪(大连依利特)；UV230Ⅱ紫外-可见检测器；AL204电子分析天平(梅特勒)，精确度1×10-5g；超声波清洗器(KQ-50B)；pH计(上海雷磁PHSJ-3F)。

1.2 试剂

绿原酸对照品(上海源叶，批号Y24J7K16726，供含量测定用)；甲醇(色谱纯，SIMARK)；乙腈(色谱纯，SIMARK)；磷酸(分析纯，天津天力)；水(纯化水，自制)。

1.3 样品

利咽饮3批(仙桃市第一人民医院制剂室自制，250mL/瓶，批号20171203、20180201、20180611)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(9∶91)，检测波长为327 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，理论塔板数按绿原酸计算不低于1000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品11.6 mg于25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取上述对照品储备液1 mL于25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液(18.56 μg/mL)。

2.2.2 供试品溶液制备 精密量取利咽饮溶液2mL于25mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，临用前用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2.3 系统适应性实验

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按照“2.1”项色谱条件分析，绿原酸对照品及利咽饮供试品色谱图如图1、图2所示。结果显示，在与绿原酸对照品相同的保留时间处，利咽饮样品出现相对应的色谱峰且无其他杂峰出现，说明利咽饮中的其他成分对测定无干扰。

图1 绿原酸对照品色谱

图2 利咽饮色谱及出峰数据

2.4 线性关系考察

分别精密吸取不同体积的绿原酸对照品储备液，加50%甲醇稀释成9.28、13.92、18.56、23.20、55.68 μg/mL的溶液，分别按照“2.1”项下色谱条件依次进样，每个浓度的溶液进样2次，记录色谱图。以平均峰面积A为纵坐标(Y)，以对照品质量浓度C为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为A=19.27C+34.52，R2=0.999 0。结果表明，绿原酸在9.28～55.68 μg/mL的浓度范围内，其峰面积与其质量浓度线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取绿原酸对照品溶液10 μL，分别在“2.1”项下色谱条件下重复进样6次，对照品峰面积结果见表1，计算绿原酸对照品的平均峰面积为382.03，RSD=0.18%，结果表明对照品溶液精密度良好。

表1 精密度实验结果

2.6 稳定性实验

精密吸取上述供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件操作，分别于放置0 h、2 h、6 h、8 h、12 h后进样，进样量为10 μL，记录色谱图，测得绿原酸的峰面积结果见表2，计算绿原酸平均峰面积为408.01，RSD=1.01%，结果表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

表2 稳定性实验结果

2.7 重复性实验

精密吸取供试品溶液2 mL，按照“2.2.2”项下供试品溶液的配制方法配制6份，按照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，供试品峰面积结果见表3，计算得绿原酸平均峰面积为420.71，RSD=1.35%(n=6)，结果表明本实验重复性良好。

表3 重复性实验结果

2.8 加样回收率实验

精密移取已知绿原酸含量的同一批号的利咽饮(批号20171-203)2 mL于25 mL容量瓶中，再分别加入绿原酸对照品储备液1 mL，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，临用前用微孔滤膜过滤，如此平行配制6份，在“2.1”项下色谱条件下进行分析，测定含量，计算回收率。结果表明，平均回收率为99.06%，RSD为0.51%(n=6)，结果见表4。

表4 利咽饮加样回收率试验

2.9 样品测定

取3个批号的利咽饮(批号20171203、20180201、20180611)，按照“2.2.2”项下供试品溶液的配制方法，在“2.1”项下色谱条件进行测定，按外标法计算含量，平均含量为(0.2320±0.0042)mg/mL。结果表明，不同批号的样品中绿原酸的含量差异不大，RSD为1.7%，按照“2.1”项下色谱条件，可准确测定利咽饮中绿原酸的含量，结果见表5。

表5 利咽饮中绿原酸含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长选择

采用紫外全波长扫描，绿原酸对照品溶液及供试品溶液在327 nm处有最大吸收，灵敏度高，因此选择在327 nm处检测绿原酸。

3.2 流动相选择

忍冬科植物金银花属我国来源广泛、全国各地均有种植的中药材之一。以其中含有的重要有效成分绿原酸作为主要质量控制指标之一，参考不同植物中绿原酸的含量测定方法[8-9]，再按照《中华人民共和国药典》2015年版方法，选择乙腈与0.4%磷酸水溶液作为流动相。结果表明，当采用乙腈-0.4%磷酸溶液(12∶88)作为流动相时，绿原酸和其后两个峰的分离度较差，结果见图3；当采用乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90)作为流动相时，绿原酸和其前面的峰分离度达不到要求，结果见图4；当采用乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)作为流动相时，各峰出峰时间推迟，峰宽增加明显，峰高降低显著，柱效降低，绿原酸后两个峰分离度较差，结果见图5；当采用乙腈-0.4%磷酸溶液(9∶91)作为流动相时，绿原酸在9.28～55.68 μg/mL的浓度范围内，峰面积与其质量浓度线性关系良好，各峰出峰时间适宜，峰形良好，各峰分离度良好，结果见图6。故实验选择乙腈-0.4%磷酸溶液(9∶91)作为流动相。

流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(12∶88)

流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90)

流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)

流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(9∶91)

3.3 利咽饮口服液的质量评价标准

随着我国经济的快速发展，空气质量每况愈下，急慢性咽炎已经成为困扰人们生活和学习的临床多发病、高发病之一。与现代西医相比，中医作为我国传统医学，对急慢性咽炎的治疗，疗效更显著，且副作用较小[10]，在临床上应用广泛。

利咽饮在湖北省仙桃市第一人民医院多年临床实践中取得了良好的治疗效果，是治疗急慢性咽炎[11]的有效中成药之一。其具有滋阴清热、化痰利咽的功效，可用于缓解风热病邪所致的咽噪口干、失音、声哑等症状的治疗。方中金银花与连翘清热、泻火、解毒，能消咽喉之肿；玄参清热凉血滋阴降火，能滋润咽喉；桔梗与胖大海宣肺祛痰、利咽解毒，能开嗓祛痰。诸药合用，共奏滋阴清热、化痰利咽之功效。金银花作为利咽饮的主要有效成分之一，可用于各种热病，属于中医清热解毒的良药之一，对热毒疮痈、咽喉肿痛之证疗效显著[12]。绿原酸是金银花的主要药理活性成分之一[13]，在《湖北省医院制剂规范(2011年版)》中，仅对绿原酸进行了薄层色谱鉴别，未对其含量进行控制。目前中药中绿原酸的含量测定方法有HPLC法、液相色谱-质谱联用法、紫外分光光度法及高效毛细管电泳法等[14]，而HPLC法测定的结果最为准确，且具有重复性好、灵敏度高的优点。因此，为确保利咽饮的疗效，本研究建议将HPLC法测定绿原酸的含量作为其质量控制的主要指标。

4 结论

本文建立的利咽饮中绿原酸含量测定方法，经方法学研究表明，具有简便、准确、重现性好的优点，该法可作为利咽饮口服液质量控制的主要指标，为利咽饮口服液的质量评价奠定基础。