一株南极篮状菌光照活性产物研究

陈 俊 陆园园*

（ 中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京211198）

真菌次级代谢产物主要有聚酮类、生物碱类、萜类、肽类和其他类化合物[1]，在不同的发酵策略下可能会发酵不同的次级代谢产物。 本研究首次报道通过白光光照一株篮状菌， 可以稳定发酵出一种聚酮化合物Rugulosin，为进一步研究其次级代谢产物生物学活性以及合成通路提供化合物基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

真菌SP14 由中国药科大学海洋药学教研室保存。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：将马铃薯淀粉1g, 葡萄糖4 g 溶于200ml 水中，121℃灭菌20 min。 浅层大米固体培养基：50ml 玻璃锥形瓶中加入10g 大米和10ml 水，121℃灭菌20 min。

1.3 分子学鉴定

以真菌SP14 基因组DNA 为模板， 使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′)扩增5.8S rDNA 序列。 PCR 使用50ul 反应体系， 反 应 条 件 为95℃预 变 性3min，95℃变 性15s，56℃退 火15s，72℃延伸30s，共35 个循环，最后72℃延伸5min。PCR 产物使用2%凝胶电泳验证纯化，回收测序。将测序结果进行Blast 比对，使用Mega-X 软件，采用邻接法（ Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树。

1.4 发酵条件优化

挑取活化的真菌SP14 接种到含200ml PDA 的500 ml 锥形瓶中，28℃，200rpm 震荡培养4 天得种子液，吸取2ml 种子液接种在浅层大米固体培养基上，设置光照组与避光组。 光照组：每组3 个平行培养瓶。 避光组：每组3 个平行培养瓶，使用避光锡箔纸包裹。 将两组培养瓶置于28℃恒温光照培养箱中，每24小时观察取样，HPLC 检测，第三天至至七天每天取样，第7 天至第17 天间隔取样。光照培养箱的光照功率为48w。HPLC 分析条件为：流速为1ml/min，流动相乙腈和水分别添加0.1%甲酸。梯 度 洗 脱 程 序 为：0-5 min，5%乙 腈；5-25min，5-100%乙 腈；25-26min，100-5%乙腈；26-30min，5%乙腈（ 下同）。

1.5 活性产物分离纯化

将真菌SP14 种子液接种在1kg 浅层大米固体培养基上，28℃。 光照培养20 天。 发酵结束后，使用乙醇超声提取3 次，合并减压浓缩得到粗提物浸膏。 粗提浸膏经过大孔吸附树脂柱层析粗分， 依次用纯水，20%，40%，60%，80%，100%乙醇水梯度洗脱，HPLC 检测其主要富集在60%组分（ 1.036g）；将60%组分减压浓缩后使用ODS 层析柱分离， 依次用20%，40%，60%，80%，100%甲醇水梯度洗脱，HPLC 检测其主要在80%-2 组分（ 47.8mg）；将上述组分减压浓缩后使用Sephadex LH-20 凝胶分离，流动相为甲醇，用试管分管收集后使用HPLC 检测纯度后合并减压浓缩得黄色化合物(17.6mg)。

2 结果与分析

2.1 真菌种属鉴定

PCR 产物条带单一，经测序，其分子量大小为580bp。将序列上传至NCBI 数据库进行Blast 比对，选取同源性较高的7 条序列构建系统进化树，结果显示，真菌SP14 与两株篮状菌聚为一支且这两支分支的同源性较高， 确定真菌SP14 为Talaromyces Rugulosin SP14（ 图1，2）。

2.2 发酵条件的优化

在以活性为指标的真菌筛选中，发现Talaromyces Rugulosin SP14 上下层培养基颜色不一（ 上黄下青），推测光照可能影响了真菌SP14 的次级代谢产物谱。 以光照为变量，进行光照和避光培养。 结果显示， 光照组于第三天观察到黄色化合物， 同时HPLC 显示，与避光组相比，在保留时间22.3 min 处，光照组检测出一个特征峰， 且随着发酵时间的延长而变成主要次级代谢产物，而避光组在此保留时间则没有特征峰出现，结合培养基颜色状态及HPLC 检测曲线，确定该黄色化合物为活性化合物（ 图3）。

图1 Lane1：2 K Marker; Lane2：5.8S rDNA

图2 SP14 系统进化树

图3 光照与避光组HPLC 检测曲线（ D-Dark L-Light）

2.3 化合物结构鉴定

黄色化合物：固体，易溶于DMSO，分子式为C30H22O10。1H-NMR (500MHz，DMSO-d6)，δ：14.60(2H，brs，1-OH，1'-OH)，2.76(2H，d，J=5.17Hz，H-2，H-2')，4.41(2H，s，H-3，H-3')，5.40(2H，brs，3-OH，3'-OH)，3.38(2H，brs，H-4，H-4')，7.45(2H，d，J=1.2Hz，H-6，H-6')，7.18 (2H，d，J=1.2Hz，H-8，H-8')，11.58 (2H，s，9-OH，9'-OH)，2.42 (6H，s，H-15，H-15')。 13C-NMR (500MHz，DMSO-d6)，δ：186.0(C-1，C-1')，58.4(C-2，C-2')，68.5(C-3，C-3')，47.8 (C-4，C-4')，55.6 (C-5，C-5')，120.4 (C-6，C-6')，147.4(C-7，C-7')，123.9 (C-8，C-8')，160.2 (C-9，C-9')，114.2(C-10，C-10')，180.6(C-11，C-11')，106.0(C-12，C-12')，194.0(C-13，C-13')，131.9(C-14，C-14')，21.4(C-15，C-15')。 以上数据与文献中[2]报道基本一致，确定其为Rugulosin。

3 讨论

本文研究了从南极海泥中分离筛选出来的一株篮状菌Talaromyces Rugulosin SP14， 通过白光光照稳定了活性次级代谢产物的发酵并从其固体发酵物中分离出来一种活性次级代谢产物Rugulosin，文献报导，该化合物对MRSA 有比较好的抑菌活性[2]，其MIC 值为0.125ug/ml。 Rugulosin 最先自Penicillium rugulosum 菌中分离出来，前期研究显示，Rugulosin 对HIV 病毒有抑制作用[3]，并且对链球菌及棒状杆菌有很强的抑制活性，并能引起枯草芽孢杆菌DNA 损伤，但对革兰氏阴性菌抑制作用较小[4]，对大鼠肝脏和大肠杆菌的核糖核酸聚合酶以及大鼠肝脏和梨形四膜虫的核糖核酸酶H 也有比较强烈的抑制作用[5]。 部分研究显示，真菌来源的Rugulosin 对热休克蛋白90(Hsp90)的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性有较强的抑制作用，分子对接显示，Rugulosin 与Hsp90 N 端之间存在较强的相互作用，二者通过氢键形成静态复合物同时可以使Hsp90 N 端的α- 螺旋含量下降3.4%，从而使Hsp90 N 端的二级结构发生改变[6]。 在一些肿瘤细胞中，Hsp90 可以维持较高的表达量，继而影响多种肿瘤相关蛋白，如Bcr-abl，Akt，C-Raf，CDK4 以及Her2 等的表达[7]，所以Hsp90 抑制剂可以作为抗肿瘤细胞的先导化合物，因此有潜力进一步将Rugulosin 开发成为分子探针去研究与Hsp90 相关的信号通路[8]。 此外Rugulosin 作为一种真菌毒素，已被ABcam公司开发为RNA 聚合酶的小分子抑制剂。 在农业应用上，Rugulosin 具有抗菌和杀虫活性，在一些植物内生真菌的次级代谢产物中也发现有Rugulosin 的存在，因此将其用作一种生物杀虫剂，以减少化学杀虫剂的使用，是一种环境友好型的生物杀虫剂[9]。

本研究首次报道了白光光照对篮状菌属真菌活性次级代谢产物的影响， 将避光粗提物置于光照培养箱中光照刺激，HPLC没有检测出Rugulosin 的存在， 说明其并不是光照催化而形成的，而是由真菌自身代谢形成，其中可能涉及到一些转录调控因子的参与。 真菌可能为适应极地极昼极夜环境而进化演变出独特的对光敏感的次级代谢机制，光照因素也为今后研究极地海洋真菌次级代谢产物提供一个新的思路和依据。