池塘沉积物对上覆水脱氮作用的初步探究

付贤茂，罗国芝,2,3，刘文畅，谭洪新,2,3

(1 上海海洋大学，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；2上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点试验室，上海 201306；3上海海洋大学，水产科学国家级试验教学示范中心，上海 201306)

氮循环是水产养殖生态系统物质循环的一个重要组成部分。养殖活动中，饲料等输入的氮量占整个养殖系统总氮输入量的90%[1]。但其中只有不到25%的氮被养殖对象转化到体内，大约有30%总氮(TN)以残饲、粪便形式进入池塘水体或沉积物中[2]。沉积物作为养殖池塘氮和其他元素的集中地，脱氮生物群落在其中扮演着重要角色[3]。沉积物不但能够吸附水体中的氮、磷、硫等元素，调节水体水质状况，而且是益生菌以及底栖生物生长繁殖的场所。但是沉积物积累会逐渐败坏水质、释放硫化氢等有毒物质[4-5]。一般采用晒塘和挖掘方法去除沉积物和污染物，但是这种方式无法避免更深层的氮素再矿化，挖掘出来的沉积物也会对环境造成污染[6]。因此，基于生物脱氮的原位修复方法可能更安全和更经济[7]。

以碱度为调控因子，研究池塘沉积物上覆水的脱氮效果和微生物群落，初步分析其脱氮规律以及微生物特性。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

1.2 试验沉积物反应器设置

采用12个室内玻璃纤维反应器(直径30 cm，高50 cm，工作体积15 L)开展试验，设置A组(对照组)、B组、C组、D组，每组3个重复。每个容器接种10 cm搅拌均匀的沉积物样品。试验废水采用人工配水[13]，并通入N2使溶氧达到1.5～2.0 mg/L。为避免搅动沉积物，使用虹吸法向每个反应器加入2 L人工配水。反应器用锡箔纸密封避光，试验用小苏打(NaHCO3)调控碱度，各组投加量：A组0 mg/L，B组300 mg/L，C组500 mg/L，D组700 mg/L；初始碱度(以CaCO3计)分别为(143.3±7.10)mg/L、(275.2±22.01)mg/L、(385.1±28.01)mg/L和(466.5±61.50)mg/L。

1.3 检测方法

R=(C1-C2)/C1×100%

(1)

总DNA提取及PCR扩增：使用DNA提取试剂盒从样本中提取DNA，使用 Qubit© dsDNA HS Assay Kit检测。以 20～30 ng DNA为模板，使用PCR引物扩增原核生物16SrDNA上包括V3及V4的2个高度可变区。上游引物序列为(CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT)，下游引物为(GGACTACNVGGGTWTCTAATCC),PCR扩增体系(25 μL)TransStart Buffer2.5 μL，dNTPs.2 μL，primers.1 μL × 2，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板DNA 20 ng，ddH2O补至总体积25 μL。PCR 反应参数：预变性参数94 ℃ 3 min × 1，变性参数94°C 5 sec，退火参数 57 ℃ 90 sec，延伸72 ℃ 10 s，终延伸参数72 ℃ 5 min，共进行24个循环。

高通量测序：采用Illumina MiSeq测序系统对采集的底泥样品进行高通量测序。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 上覆水脱氮作用的影响

表1 试验期间沉积物水处理效果

图1 试验期间总氮(a)、氨氮(b)、亚硝酸盐氮(c)及硝酸盐氮(d)的动态变化

试验期间碱度变化如图2所示。A组试验过程中碱度维持稳定，但是B、C和D组碱度均呈下降趋势，最终分别降至(160.66±17.70)mg/L、(191.53±25.09)mg/L和(226.89±20.23)mg/L。

图2 试验期间各组碱度动态变化

2.2 沉积物微生物群落动态分析

高通量测序鉴定出门水平微生物群落相对丰度如图3所示。

图3 初始沉积物组与试验组优势菌群在门水平上的分布

初始沉积物与试验组系统中主要是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和Epsilonbacteraeota。其中，变形菌门(68.1%±2.95%)丰度相对较高，占主导地位。而经试验驯化绿弯菌门与酸杆菌门相对丰度降低，分别从初始相对丰度9.48%，5.27%降低至5.7%，2.58%。硝化螺旋菌门随着试验时间的增加，其相对丰度也随之增加。但试验组与对照组微生物群落之间无明显差异(P>0.05)，而与初始沉积物有显著性差异(P<0.05)，这可能是因为试验环境与池塘环境略有不同导致。

图4所示为沉积物属水平微生物相对丰度，其中硫杆菌(Thiobacillus)、(f__Steroidobacteraceae_Unclassified)和硫碱螺旋菌属(Thioalkalispira)为主要优势菌属。未鉴别菌属(Unclassified)相对丰度比例为10.77%～11.07%。其中硫杆菌(Thiobacillus)和Sulfurimonas是一类常见的自养型脱氮硫杆菌，主要与硫自养反硝化有关。值得注意的是，在试验组中发现了硫碱螺旋杆菌属(Thioalkalispira)(5.6%)，其相对丰度比初始沉积物(0.4%)较高。f__Steroidobacteraceae_Unclassified(12.6%)在初始沉积物中占主要优势菌种，但试验组在驯化其相对丰度显著下降至4.3%。

图4 初始沉积物组与试验组优势菌群在属水平上的分布

3 讨论

3.1 沉积物上覆水脱氮作用的影响

本研究发现，不同碱度水平下，沉积物上覆水的水质无显著差异。水体中的TN去除效果明显，说明沉积物对养殖水体中氮元素有一定的去除效果，与研究利用褐煤作为碳源对池塘沉积物中厌氧氨氧化与反硝化作用无添加碳源组的结果相似[15]，表明沉积物具有脱氮效果。

3.2 微生物群落分析

4 结论

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