近红外光谱法快速测定仿刺参品质相关指标的研究

陈 梦，李尚俊，孙国华，冯艳微，王卫军，杨建敏，左 闪，温争争

(1 上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306；2 山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室，山东 烟台 264006；3 鲁东大学农学院，山东 烟台 264025)

海参(Sea cucumber)属棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothu roidea)，全世界已发现有1 100种海参，中国有140多种；可食用的海参世界上只有40种，中国约有20种，其中只有10种有较高的商业价值，仿刺参(Apostichopusjaponicus)为其一[1-2]。海参品质的研究指标主要有蛋白质、皂苷、多糖、氨基酸、脂肪酸、维生素含量等常规营养指标。此外有研究者对仿刺参体壁和内脏的16种无机元素含量进行测定，发现体壁和内脏中钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)含量都较高，还含有较为丰富的微量元素锌(Zn)、硒(Se)和钒(V)，普遍高于鲍鱼、海胆、鱼翅等其他海洋水产食品[3]。随着消费需求的增加，国内海参养殖规模不断扩大，世界各地的海参也纷纷涌入中国市场，造成海参产品种类繁多、品质参差不齐。海参产品的产地不同、加工方式不同、营养成分及其含量各异等因素导致其价格相差巨大。部分商贩为追求高额利润，在海参产品加工销售过程中以劣充优、掺假造假等行为时有发生，甚至有人造海参产品出现[4]。因此，建立一种安全无损快速地检测技术鉴定仿刺参营养成分的差异，不仅有助于仿刺参养殖生产过程中的品质性状筛选，而且可应用于市场上对海产品品质与质量安全进行检测和管控，对促进仿刺参养殖效益和保障产品市场健康发展均有重要意义。

近红外光谱法有着高效快速便捷的优点，已经广泛应用于中草药[5-9]、饲料生产[10-11]和化工分析[12-13]等领域，近年来，可见/近红外检测技术在水产品中的应用越来越多，但对于海参的相关报道甚少。陶琳等[14]采用近红外漫反射光谱法对4个不同产地干海参的鉴别分析，获得较满意的地理分类结果。本研究采用近红外光谱分析技术对仿刺参的蛋白质、锌和硒3个营养成分指标进行定量分析并建模，为仿刺参营养品质多种指标同时快速鉴定提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与制备

475个不同大小仿刺参样品采集于山东省东营市和烟台市等地不同养殖场和市场；将仿刺参进行解剖，去除内脏、腹部的管足、头尾部分；将每一份仿刺参取出，用匀浆机匀浆，放入样品袋中，编号，保存于-20 ℃冰箱中。将样品取出解冻，放入大型真空冷冻干燥机(ZDGX5)干燥48 h，然后迅速粉碎，装入样品袋中放入干燥器中待测。

1.2 仿刺参营养成分含量的测定

锌和硒的含量按照SN/T2208—2008方法测定[15]，蛋白质含量按照凯氏定氮法(GB5009.5—2016)测定(自动凯氏定氮仪)[16]。每个样品重复检测2次，取平均值作为化学真值。

1.3 仿刺参近红外分析

1.3.1 近红外光谱的采集

采用便携式NIR光谱仪MicroNIRTM1700(JDSU,USA)进行样品全光谱漫反射扫描，光谱波长范围为900～1 700 nm，每次光谱采集重复扫描次数为100次，单次积分时间为15 ms。样品扫描前，光谱仪开机预热至少0.5 h，并采集背景光谱来消除背景的影响和进行校准。测量时的环境温度20 ℃、相对湿度10%，将样品平铺放置，在不同位置扫描5次，取平均光谱为该样品光谱。

1.3.2 异常样品的剔除

采用马氏距离对原始光谱进行光谱异常值剔除，再用杠杆值和学生化残差检验，对各个成分的质量浓度异常样品进行分析[17]。经软件MATLAB对异常光谱的样品进行判断和剔除，然后将杠杆值和学生残差较大的样品暂定为异常样品，再采用逐一回收的方法分析该异常样品对模型性能的影响。剔除异常值后采用Kennard-Stone(K-S)算法进行样品集分类[18]，将475份样品按照2∶1划分为校正集和验证集。

1.3.3 近红外定量模型的建立和优化

采集近红外光谱信息以及测得的各成分含量，采用全光谱偏最小二乘法(PLS)建立定量模型。定量前，通过标准正态变量校正(SNV)、多元散射校正(MSC)、MSC+一阶导数和SNV+一阶导数四种预处理方法对原始光谱进行优化和比较，以选出最优的预处理方式。

1.3.4 评价指标

定量模型的评价指标：以校正决定系数(Rc2)、预测决定系数(Rp2)、预测均方根误差(RMSEP)、校正均方根误差(RMSEC)和交互验证均方根误差(RMSECV)判断模型的好坏[19-20]。如果Rp2和Rc2越接近1，RMSEC、RMSEP和RMSECV越接近0，说明模型越好。同时，通过相对分析误差(RPD)对定量模型进行进一步验证。如果RPD≥3说明模型精度高，可用于实际检测；如果2.0≤RPD<3.0，模型可用于样品的定量分析；如果RPD<2.0，模型难以用于定量检测分析[21]。

2 结果与分析

2.1 原始光谱

仿刺参个体干样的近红外原始光谱见图1。从图中可以明显看出光谱存在基线漂移和异常光谱，需要对光谱进行进一步预处理。

图1 仿刺参个体干样原始光谱

2.2 样品各成分含量值

根据上文分析方法测得的仿刺参不同品质成分质量浓度范围作为模型质量浓度矩阵分别代入所建模型，样品的蛋白质质量分数范围为31.85%～53.52%，高于测定的硒含量(0.33～15.80)μg/g，而锌含量的质量浓度范围最广，在4.67～141.05μg/g之间，说明不同产地的仿刺参，其锌含量差异较大。

2.3 剔除异常值

2.3.1 光谱异常值的剔除

采用马氏距离对光谱异常样品进行剔除，其结果如图2和图3，从图3中可以看出，异常光谱被剔除，效果明显。

2.3.2 质量浓度异常值的剔除

基于近红外光谱仿刺参的蛋白质、锌和硒的杠杆值和学生残差分布如图4～图6所示，图中包括暂时被判定为异常值的样品。表1～表3为剔除及逐一回收各质量浓度异常样品后模型Rc2、RMSEC、Rcv2和RMSECV的值。其中标注+的为保留样品，将其回收，其余定为异常样品。PC为主成分数，Rcv2为交互验证决定系数。

图2 用马氏距离剔除(红色)与保留(黑色)的光谱图

图3 剔除异常光谱后的光谱图

由图4、表1可知，蛋白质模型中，共选出24个暂定为异常样品，对其逐一回收建模，发现回收编号为2028的样品时，Rc2不变，RMSEC和RMSECV降低，模型性能得到改善，因此将编号为2028的样品作为正常样品回收，将其余样品作为异常样品全部剔除。由图5、表2可知，锌模型中，共选出25个暂定为异常样品，对其逐一回收建模，模型性能均未得到改善，故将这25个样品作为异常样品全部删除。由图6、表3可知，硒模型中，共选出22个暂定为异常样品，对其逐一回收建模，其中，回收编号为88、97、130、883、912、1247、686、1032的样品Rc2都提高或不变，但RMSEC和RMSECV也提高，说明模型稳定性较差；回收编号为555和1089的样品Rc2从0.529减小到0.528，RMSEC增大而RMSECV减小，模型性能变差。因此将22个样品作为异常样品剔除。

图4 仿刺参样品蛋白质的杠杆值-学生残差图

图5 仿刺参样品锌的杠杆值-学生残差图

图6 仿刺参样品硒的杠杆值-学生残差图

2.4 光谱预处理方法的确定

采用常用的预处理方法进行定量模型比较分析，包括标准正态变量(SNV)、多元散射校正(MSC)及算法结合。不同光谱预处理方法对仿刺参3种营养成分的分析结果见表4～表6。

由表4可知，经预处理后模型质量明显提升，Rc2和Rp2均变大，RMSEC和RMSEP都相应减小，说明这4种预处理方法对模型性能均有所改善，同时，经SNV+一阶导数预处理建立的模型RMSEC和RMSEP相对最小，Rc2和Rp2最高，故选SNV+一阶导数为蛋白质模型的最优预处理方法。对锌和硒含量PLS模型，由表5和表6可知，经MSC预处理建立的模型Rc2和Rp2优于其他预处理建立的模型，RMSEC和RMSEP均减小且差异不大，模型预测精度更好，因此确认MSC为锌和硒模型的相对最优预处理方式。

表1 仿刺参个体干样蛋白质剔除异常值后定量模型结果

表2 仿刺参个体干样锌剔除异常值后定量模型结果

表3 仿刺参个体干样硒剔除异常值后定量模型结果

(续表3)

表4 不同预处理方法的仿刺参个体干样蛋白质含量PLS模型的分析结果

注：*为最优预处理方法;Rp2表示预测决定系数；RMSEP表示预测均方根误差。下同

表5 不同预处理方法的仿刺参个体干样锌含量PLS模型的分析结果

表6 不同预处理方法的仿刺参个体干样硒含量PLS模型的分析结果

2.5 定量模型的建立

近红外光谱构建的仿刺参粗蛋白、锌和硒的PLS定量分析模型结果如图7所示。表7显示，蛋白质的Rc2和Rp2分别是0.889和0.904，相对分析误差RPD=3.22>3，说明蛋白质定量分析模型可用于实际检测；锌和硒的Rc2和Rp2均低于0.6，RPD均小于2.5，说明模型预测精度一般，建模稳定性相比蛋白质模型较差，用于测定仿刺参中锌和硒含量可能有误差。可以进一步提高优化这些元素的模型参数，达到较好的预测效果。

图7 蛋白质(a)、锌(b)和硒(c)含量预测值和实测值关系图

3 讨论

3.1 仿刺参营养成分定量模型评价

本研究探讨了近红外光谱技术对仿刺参样品中蛋白质、锌和硒进行快速定量分析的可行性。利用便携式光谱仪获得仿刺参样品的光谱数据，通过不同的光谱预处理方法结合偏最小二乘算法建立定量分析模型，结果表明，本研究获得的蛋白质近红外定量分析模型可用于实际检测，但锌和硒的模型效果不理想。近红外技术通过对样品中不同频率的含氢基团(O—H键、C—H键和N—H键等)的吸收，形成特征光谱[21-22]。由于蛋白质含氢基团比较多，在近红外产生较强吸收峰，因此，蛋白质含量模型可获得较好的定量效果。本研究中，锌和硒模型的预测决定系数较低，原因可能为：一是锌和硒则为微量元素，在仿刺参本身含量过低；二是锌和硒这类无机元素预测的可行性在于锌和硒可与其他含氢化学基团以某种方式(耦合等)进行结合，形成有机硒和锌进行间接测量，然而，因为有部分元素与样品中有机物结合得不够充分[19]，以游离形式存在，无法被NIR检测到，导致本试验中锌和硒模型的效果低于蛋白质模型。

3.2 仿刺参质量检测和品质分析的研究现状

近年来，海参养殖业不断扩大，消费者对海参的需求量也不断增加，因此，为了提高市场竞争力，需要对不同种类可食用海参进行品质测定和质量评估。国内外对海参的研究更多地集中在海参的种类区分和产地鉴定方面[23-28]，但对海参品质的研究较少，随着近红外光谱技术越来越多的应用在海产品品质成分检测，海参品质近红外检测研究也随之开展，邵月华等[29]应用傅立叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)实现对优质海参和掺糖海参的种类鉴别；邹小波等[30]建立了胶原蛋白含量预测模型， Guo等[31]建立了总脂肪含量的预测模型，相关系数均达到了0.9以上，说明效果较好。对于海参品质的评价，基于多种营养指标的综合评价有效性更高更具有实际应用价值，将近红外光谱技术与仿刺参中多种营养因素指标含量进行联合分析为快速进行仿刺参样品品质的评价提供了可能。本研究中，利用近红外光谱技术对仿刺参样品中蛋白质、锌和硒3种代表性营养指标进行了同时测定定量模型的构建，初步建立了仿刺参品质多指标综合评价近红外模型，对市场仿刺参产品品质与质量安全进行检测和管控提供了快速有效方法。

表7 仿刺参个体干样3种成分最终模型参数

4 结论

采用近红外光谱结合化学分析法建立一种仿刺参品质成分快速检测方法。采集仿刺参不同成分对应的光谱特征后，比较不同的预处理方法并采用PLS法建立仿刺参蛋白质、锌和硒含量定量模型；所建模型蛋白质、锌和硒的预测决定系数(Rp2)分别为0.904、0.498和0.526，蛋白质的RPD=3.22>3，而锌和硒的RPD均小于2.0。利用近红外光谱特征可实现仿刺参蛋白质含量的快速检测，而锌和硒的模型需要进一步优化。在今后的研究中，还可以补充不同地区、不同品种的样品，扩大仿刺参中无机元素的含量范围，调整校正模型，为刺参微量元素的快速测定提供基础。

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