程序性细胞死亡因子4基因对川崎病血清诱导血管内皮细胞凋亡的影响

孙真真，温航卫，陶凤姣，游亚兰，彭新平

作者单位：1邵阳学院附属第一医院儿科，湖南 邵阳 422000；2湖南省人民医院儿科，湖南 长沙410000

川崎病是一种全身非特异性的血管炎性疾病，主要发生于5岁以下的儿童[1]。目前，川崎病的发生机制尚不明确。研究显示，川崎病的发生与冠状动脉或中等肌性动脉内皮组织损伤有关，其中血管内皮细胞损伤是川崎病冠状动脉损伤的重要原因[2]。程序性细胞死亡因子4（programmde cell death 4，PDCD4）是近年来发现的与细胞凋亡有关的凋亡调控因子，其可通过调控基因转录和表达影响细胞的生长凋亡[3]。PDCD4不仅在人类的皮肤、肺脏、结肠、卵巢等组织中表达，在心肌细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞等多种细胞中也有表达，并且对于不同的细胞凋亡调控作用不同[4-5]。研究显示，PDCD4在高糖诱导的血管内皮细胞中表达升高，其可促进高糖诱导的血管内皮细胞凋亡[6]。2017年3月至2018年4月，本研究以明确PDCD4在川崎病血清诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用为目的，为明确川崎病血管内皮损伤发生机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料 编号128人脐静脉血管内皮细胞购自美国ScienCell；PDCD4抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；9661活化型Caspase-3（C-Caspase-3）抗体、9505活化型Caspase-9（C-Caspase-9）抗体购自美国Isoimperatorin；DP405RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；2505311逆转录试剂盒购自德国Qiagen；SR1100 Real-time PCR试剂盒购自上海索宝生物科技有限公司；Applied Biosystems PCR仪购自美国Thermo；R1200细胞总RNA提取试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；IPVH00010 PVDF膜购自美国Millipore；M2003 MTT试剂购自美国Sigma；Stratagene MX3005P Realtime PCR仪购自美国安捷伦；HBS-1096A酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；IX73倒置显微镜购自日本Olympus。

1.2 血清分离 采集2017年5月邵阳学院附属第一医院典型川崎病病儿急性期和年龄相仿的健康儿童各5例的静脉血4 mL，小儿川崎病诊断和纳入标准参照文献[7]，研究对象和正常对照的基本资料，年龄、性别和其它临床资料差异无统计学意义。标本采集经过病人及其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。在4℃，4 000 g离心15 min以后，吸取血清，保存在-80℃。实验前以0.22 μm微孔过滤器过滤。

1.3 Realtime PCR检测川崎病血清对血管内皮细胞中PDCD4表达影响 血管内皮细胞分别用含有体积分数为10%川崎病血清和体积分数为10%的正常血清细胞培养液培养，记为川崎病血清组和正常血清组。细胞培养24 h以后，用Realtime PCR方法测定细胞中PDCD4表达水平。步骤为：用细胞总RNA提取试剂盒（TRIZOL）分别提取细胞中的总RNA，RNA用DEPC水溶解并保存在-80℃冰箱中。RNA浓度及纯度检测用紫外分光光度计（其OD260nm和OD280nm的比值在1.8～2.0之间）。用逆转录试剂盒分别合成各组cDNA。引物用Primer 5.0软件设计，引物均由上海生工合成。PDCD4正向引物5′-CCAAAGAAAGGTGGTGCA-3′，反向引物5′-TGAGGTACTTCCAGTTCC-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）正向引物5′-CAACGGATTTGGTCGTATT-3′，反向引物 5′-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。再依照Real-time PCR试剂盒进行定量PCR。以2-ΔΔCT法计算PDCD4表达水平，GAPDH作为内参，取内参和目的基因的Ct值的均值，ΔCt＝Ct目的-Ct内参，ΔΔCt＝[转染组目的基因Ct值-转染组内参基因Ct值]-[对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值]

1.4 蛋白质印迹法检测血管内皮细胞中PDCD4、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（C⁃Caspase⁃3）、C⁃Caspase⁃9蛋白表达变化 取上述川崎病血清组和正常血清组细胞，添加D-hanks液将细胞洗涤3次，将孔内的液体分别吸尽，再添加含有苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，放在冰上反应10 min把裂解溶液收集转移到离心管中，以功率为80 W的超声仪超声3次，每次2 s，间隔4 s超声后，继续置于冰上裂解10 min。以4℃，12 000 g离心20 min，把蛋白上清液转移并保存。吸取蛋白样品，依照BCA方法分别检测蛋白浓度。将蛋白样品添加至同体积的2×上样缓冲液中混匀，以100℃煮沸5 min，每个孔中上样量为40 μg。设置浓缩胶中电泳电压为70 V，电泳30 min以后，设置分离胶中电压为120 V，电泳90 min。裁剪合适大小的PVDF膜，置于4℃，100 V条件下转膜，转膜进行70 min。以5%牛血清白蛋白封闭液在37℃孵育90 min后，再与400倍稀释的PDCD4一抗在室温中孵育2 h，PVDF膜同1∶2 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗在37℃孵育90 min以后，分别滴加显色液，测量蛋白灰度值，GAPDH作为内参，分析目的蛋白表达水平。目的蛋白水平＝目的蛋白灰度值÷GADPH灰度值。

1.5 细胞转染 血管内皮细胞汇合度为40%时添加病毒液，MOI＝30，病毒感染12 h后进行换液，用嘌呤霉素2 μg/mL抗性筛选转染成功的细胞。血管内皮细胞中转染PDCD4 siRNA和siRNA Control后用含有体积分数为10%川崎病血清的细胞培养液培养，分别记为si-PDCD4＋川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组。川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组、si-PDCD4＋川崎病血清组细胞培养24 h以后，按照1.3和1.4中Realtime PCR和蛋白质印迹法检测细胞中PDCD4表达水平。

1.6 MTT检测下调PDCD4对川崎病血清条件下血管内皮细胞增殖影响 血管内皮细胞以密度为2×104/mL种植到96孔板内，按照正常血清组、川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组、si-PDCD4＋川崎病血清组分组处理，在培养24 h以后将培养板取出。每个孔内添加20 μL的MTT溶液，放置于37℃孵育4 h，将上清溶液吸弃，继续添加150 μL的DMSO，放置于摇床上震荡10 min。测定波长570 nm的OD值，以不含细胞的孔调零，计算细胞存活率。细胞存活率＝（实验组OD值÷正常血清组OD值）×100%。

1.7 流式细胞仪检测下调PDCD4对川崎病血清条件下血管内皮细胞凋亡影响 按照正常血清组、川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组、si-PDCD4＋川崎病血清组分组处理，继续培养24 h以后，以PBS洗涤3次，制成单细胞悬浮液。1 000g离心10 min，分别在细胞中添加195 μL的Annexin V-FITC结合液，再添加10 μL的PI，放置于避光环境孵育15 min以后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞凋亡率＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。

1.8 统计学方法 实验数据用SPSS 21.0软件进行分析。观测资料均为计量资料，用表示，两组比较为两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 川崎病血清处理后血管内皮细胞中PDCD4表达水平检测结果 正常血清组和川崎病血清组细胞中 PDCD4 mRNA 水平分别为：（1.00±0.01）、（3.51±0.36），PDCD4蛋白蛋白水平分别为：（0.26±0.08）、（0.57±0.06）。川崎病血清组细胞中PDCD4 mRNA和蛋白表达高于正常血清组（P＜0.05）。

2.2 PDCD4 siRNA对川崎病血清处理的血管内皮细胞中PDCD4表达影响检测结果 川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组和si-PDCD4＋川崎病血清组细胞中PDCD4 mRNA水平为：（1.00±0.01）、（0.91±0.09）、（0.41±0.06），PDCD4 蛋白水平为：（0.64±0.06）、（0.65±0.08）、（0.30±0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清组细胞中PDCD4 mRNA和蛋白表达水平低于川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组（P＜0.05）。

2.3 下调PDCD4对川崎病血清条件下血管内皮细胞增殖影响检测结果 正常血清组、川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组、si-PDCD4＋川崎病血清组细胞存活率为：（100.00±0.00）%、（72.01±7.32）%、（71.57±9.05）%、（89.52±6.80）%。川崎病血清组细胞存活率低于正常血清组（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清组细胞存活率高于川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组（P＜0.05）。

2.4 下调PDCD4对川崎病血清条件下血管内皮细胞凋亡影响检测结果 正常血清组、川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组、si-PDCD4＋川崎病血清组细胞凋亡率为：（6.32±0.58）%、（21.26±2.31）%、（22.58±1.79）%、（16.47±1.24）%。川崎病血清组细胞凋亡率高于正常血清组（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清组细胞凋亡率低于川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组（P＜0.05）。见图1。

2.5 下调PDCD4对川崎病血清条件下血管内皮细胞中C⁃Caspase⁃3、C⁃Caspase⁃9蛋白表达影响检测结果 川崎病血清组细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平高于正常血清组（P＜0.05）。si-PDCD4＋川崎病血清组细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平低于川崎病血清组、si-NC＋川崎病血清组（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

川崎病可引起心肌炎、冠状动脉扩张、心脏病等并发症，研究显示，川崎病血管内皮功能损伤是其发生的重要原因之一[8]。川崎病病人血清可以诱导血管内皮细胞凋亡并抑制细胞增殖[9]。本研究的结果显示，川崎病病人血清处理后的血管内皮细胞凋亡率升高，细胞增殖能力降低，说明川崎病血清具有损伤血管内皮细胞的作用。

图1 流式细胞术检测下调PDCD4对川崎病血清处理的血管内皮细胞凋亡影响

表1 下调PDCD4后对川崎病血清处理的血管内皮细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达影响/

表1 下调PDCD4后对川崎病血清处理的血管内皮细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达影响/

注：PDCD4为程序性细胞死亡因子4；C-Caspase-3为活化型Caspase-3，C-Caspase-9为活化型Caspase-9；与正常血清组比较，aP＜0.05；与川崎病血清组比较，bP＜0.05；与si-NC＋川崎病血清组比较，cP＜0.05

images/BZ_104_238_461_1192_520.png0.27±0.04 0.56±0.08a 0.57±0.05 0.41±0.02bc 22.193 0.000正常血清组川崎病血清组si-NC＋川崎病血清组si-PDCD4＋川崎病血清组F值P值6 6 6 6 0.18±0.03 0.33±0.04a 0.35±0.06 0.25±0.03bc 10.443 0.004

PDCD4是在小鼠体内发现的凋亡相关基因，后续在人类和大鼠体内均发现有PDCD4表达。人类PDCD4基因定位于10q24染色体上，其cDNA全长为3.5 kb。PDCD4编码的基因由469个氨基酸组成，其氨基端含有两个α-螺旋结构域，这两个α螺旋结构能够同翻译起始因子结合，从而抑制核糖体复合物的形成及蛋白质的合成[10-12]。PDCD4参与细胞的凋亡过程，其过表达可促进细胞凋亡[13]。研究显示，PDCD4在血管内皮细胞损伤中表达上调，其表达水平的高低与血管内皮细胞凋亡呈正相关[14]。本研究的结果表明，川崎病病人血清处理后的血管内皮细胞中PDCD4表达上调，下调PDCD4能够抑制川崎病血清诱导的血管内皮细胞凋亡，提示PDCD4可能参与川崎病血清诱导的血管内皮细胞损伤发生。

细胞凋亡是机体维持内环境稳定的重要途径，其发生受到细胞内多种基因和蛋白的调控。研究显示，Caspase蛋白家族参与细胞凋亡发生，其中Caspase-3等是细胞凋亡的效应物，Caspase-9等参与细胞凋亡激活和打靶等过程。Caspase蛋白家族成员以没有活性的酶原形式存在，其只有被激活后可以诱导细胞凋亡发生[15-17]。Caspase蛋白家族成员参与血管内皮细胞凋亡过程，在动脉粥样硬化、糖尿病心肌病等血管内皮细胞凋亡中均已经证实[18-19]。本研究的结果显示，川崎病血清可以激活血管内皮细胞中Caspase-3和Caspase-9，说明川崎病血清可能通过活化细胞中Caspase-3和Caspase-9诱导血管内皮细胞凋亡。我们的实验还表明下调PDCD4后，川崎病血清诱导的血管内皮细胞活化的Caspase-3和Caspase-9表达水平降低，提示下调PDCD4可能通过降低川崎病血清诱导的细胞Caspase-3和Caspase-9的活化减少血管内皮细胞凋亡，保护细胞免受损伤。

总而言之，川崎病血清可以通过上调PDCD4的表达诱导血管内皮细胞凋亡，下调PDCD4表达降低了川崎病血清诱导的血管内皮细胞凋亡。本研究结果为以后研究川崎病发病机制奠定了基础，为研究PDCD4在川崎病发生中的作用提供了参考。本研究只在体外进行了细胞实验，没有在体内及原代血管内皮细胞中进行验证，在后续实验中会对这部分内容进行探讨。