舌下含服免疫治疗对效应性T 细胞和调节性T 细胞功能的影响

戴 飞，魏瑾瑾，汤欣玥，陈 峥，蔺 林

复旦大学附属华山医院北院耳鼻咽喉头颈外科，上海201907

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）对世界10%～40%的人口造成影响，降低其生活质量，损伤其劳动能力，加重家庭和社会的经济负担[1]。药物治疗，包括口服或局部用抗组胺药、鼻用激素、局部用色甘酸钠或白三烯受体拮抗剂，并不能改变AR 的自然发病进程，而且会带来不良反应[2]。免疫治疗，无论是皮下免疫治疗（subcutaneous immunotherapy，SCIT）还是舌下含服免疫治疗（sublingual immunotherapy，SLIT），不仅能使患者脱敏从而缓解临床症状，还能维持长期疗效[3]。尤其是SLIT，不但更安全，而且患者耐受性更好[4]，但该治疗方式的作用机制目前尚不十分清楚。

本研究旨在探讨SLIT 对AR 炎症反应中效应性T 细胞（effector T cell，Teff）和调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）功能的影响及其可能的机制。

1 对象与方法

1.1 病例资料

选择2016 年1 月—2018 年12 月复旦大学附属华山医院北院耳鼻咽喉头颈外科招募的20 例AR 患者完成研究。诊断标准：①依据《变应性鼻炎及其对哮喘的影响（ARIA）指南（2016 年修订版）》[Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma （ARIA） guidelines-2016 revision][1]及《 变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015 年，天津）》[5]的建议，具有相应的临床症状和体征。②变应原皮肤点刺试验（skin prick test，SPT）阳性（其标准为皮肤表面风团面积＞ 7 mm2或直径＞3 mm，使用德国默克集团Allergopharma公司的阿罗格点刺液）。③变应原血清特异性IgE 检测阳性（≥0.35 kU/L，使用德国EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG 公司试剂盒）。本研究纳入符合上述诊断标准且只对粉尘螨和屋尘螨存在过敏的上海地区AR患者，年龄18 ～75 岁，性别不限。排除伴有下列情况的上海地区AR 患者：对粉尘螨过敏原检测阴性，间歇性或持续性中-重度哮喘，长期使用口服抗组胺药治疗，近1个月之内使用过全身激素治疗，伴慢性阻塞性肺部疾病，伴严重心脏病、肝硬化、尿毒症，有激素使用禁忌证，对甘油过敏，处于妊娠期的AR 女性患者，伴恶性肿瘤，符合粉尘满滴剂禁忌证患者，近3 个月内参加过其他临床试验者。本研究得到复旦大学附属华山医院伦理委员会的批准（编号：2016-312），所有患者均签署了知情同意书。

1.2 干预方法

按照厂家的规定剂量，采用粉尘螨滴剂（浙江我武生物科技股份有限公司）进行干预。其中粉尘螨滴剂1 号浓度为1 μg/mL，粉尘螨滴剂2 号浓度为10 μg/mL，粉尘螨滴剂3 号浓度为100 μg/mL，粉尘螨滴剂4 号浓度为333 μg/mL，粉尘螨滴剂5 号浓度为1 000 μg/mL；装量均为2 mL。

1.3 外周血单个核细胞的获取

分别在治疗前及治疗24 个月和30 个月时获取AR 患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），一部分用于检测Teff 和Treg 所占CD4+T 细胞百分比及2 种细胞中钙释放激活钙通道调节分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）蛋白的浓度和Ca2+平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI），一部分用于体外培养的相关试验。

1.4 流式细胞仪检测

所获PBMC 经过离心（200×g）10 min 处理后，将细胞浓度调整至5×105个/mL，用CD4、CD25 和CD127单克隆抗体以及叉头框蛋白3（forkhead box P3，Foxp3）染色试剂盒（均购于美国MyBioSource）分离并鉴定Teff（CD4+CD25-CD127high） 和Treg（CD4+CD25+Foxp3+CD127low），并用流式细胞仪相关软件FlowJo 对Teff 和Treg所占CD4+T 细胞百分比进行分析；向上述浓度细胞悬液中加入Fluo-3 Ca2+荧光探针（5 μmol/L）（美国Abcam）以检测Teff 和Treg 中游离Ca2+浓度（以Ca2+MFI 代表其浓度），所得数据用Becton Dickinson CellQuest 软件进行分析。

1.5 ELISA 检测

将细胞悬液离心，加入RIPA 裂解液，用ORAI1 ELISA 试 剂 盒（美 国MyBioSource）检 测Teff 和Treg 中ORAI1 的含量；同样，用白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）和IL-10 ELISA 试剂盒（均购于美国MyBioSource）对培养基上清中的细胞因子IL-4 和IL-10 的浓度进行检测。

1.6 细胞培养

将从PBMC 中分离的Teff 和Treg 分别进行体外培养，将2 种细胞浓度调整至5×105个/mL，移入T 细胞培养液（含有RPMI-1640、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、50 μmol/L β-巯基乙醇和100 U/mL IL-2），并加入30 μg/mL 粉尘螨滴剂，体外培养7 d，然后进行后续检测。

1.7 免疫荧光检测

将Teff 和Treg 爬片48 h，用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）清洗，然后以4%多聚甲醛在室温下固定，用含有0.2% Triton X-100 的PBS 溶液（PBS-T）洗涤，3%牛血清白蛋白封闭30 min，再将样品与ORAI1单克隆抗体（美国MyBioSource，MBS150032）在室温下孵育过夜，PBS 清洗，然后与结合了异硫氰基荧光素（fluorescein isothiocyante，FITC）的抗体在室温下避光孵育1 h，洗涤后以浓度为10 mg/mL 的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在室温下进行细胞核染色5 min，最后用防荧光淬灭剂封片，用激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica 公司，型号TCSSP5）检测，并以LCS（Leica confocal software）Lite 软件分析。

1.8 含人ORAI1 短发夹RNA 的慢病毒的制备及转染

含人ORAI1 短发夹RNA （short hairpin RNA，shRNA）的慢病毒（lentivirus，lenti）的制备、鉴定和转染均由上海汉恒生物科技有限公司完成。首先根据ORAI1 基因的转录本设计小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）靶点，合成引物（上游引物5'-TTTGCCCTCATGATCAGCAC-3'， 下游引物5'-TTGGCGACGATGACTGATTC-3'）。将单链的引物退火成双链oligo 序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体（含有ZsGreen1 绿色荧光蛋白标签），将转化子进行测序验证，然后把测序验证正确的克隆进行高纯度质粒抽提；接着在293T 细胞中包装慢病毒，包装完成后即形成带有ORAI1 shRNA 的lenti（lenti-ORAI1）。按照感染复数=10，将浓度为1×109TU/mL 的lenti-ORAI1 加入Teff 和Treg 培养基进行转染。转染1 周后收集细胞以Western blotting 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-IR-R304）进行ORAI1 蛋白表达水平检测，以 β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，使用ORAI1 单克隆抗体（美国MyBioSource，MBS150032）进行抗原抗体反应。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 6 软件进行统计学分析。所得数据经检验呈正态分布，用±s 表示。组内、组间差异的比较采用配对t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC 中Teff 和Treg 所占CD4+ T 细胞百分比的变化

在治疗前及治疗24 个月和30 个月时获取AR 患者的PBMC，用流式细胞仪检测其中Teff 和Treg 所占CD4+T 细胞百分比。根据相关研究[6]，Teff 细胞表面标志为CD4+CD25-CD127high，Treg 为CD4+CD25+Foxp3+CD127low。结果显示，治疗24 个月时Teff 所占CD4+T 细胞百分比显著少于治疗前（即0 个月时）（P=0.000），而治疗30 个月时Teff 所占百分比又显著少于治疗24 个月时（P=0.027）（图1A、B）；但Treg变化情况正好相反，治疗24 个月时Treg 所占CD4+T 细胞百分比显著多于治疗前（P=0.000），而治疗30 个月时Treg 所占百分比又显著多于治疗24 个月时（P=0.008）（图1C、D）。

图1 治疗24 个月和30 个月时PBMC 中Teff 和Treg 的流式细胞检测及其占CD4+ T 细胞百分比的变化 Fig 1 Flow cytometry analysis of Teff and Treg in PBMC and changes of percentages of them in CD4+ T cells 24 and 30 months after treatment

2.2 Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白表达和Ca2+ MFI 的变化

ORAI1 蛋白对T 细胞的各种功能有着至关重要的作用[7]，因此本研究分析SLIT 是否能够影响T 细胞亚群Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白的表达。ELISA 检测结果显示，治疗24 个月时Teff 中ORAI1 蛋白的表达显著少于治疗前（P=0.000），而治疗30 个月时Teff 中的表达又显著少于治疗24 个月时（P=0.003）（图2A）；但Treg 中的变化情况相反，治疗24 个月时Treg 中ORAI1 蛋白的表达显著多于治疗前（P=0.000），而治疗30 个月时ORAI1 蛋白的表达又显著多于治疗24 个月时（P=0.007）（图2B）。

ORAI1 蛋白的功能是促进细胞外Ca2+的内流，从而影响细胞的各种活动[8]，因此我们又对Teff 和Treg 中Ca2+MFI 的变化进行了分析。结果表明，Ca2+MFI 的变化与ORAI1 蛋白的表达趋势基本一致，治疗24 个月时Teff 中Ca2+MFI 显著少于治疗前（P=0.000），而治疗30 个月时Teff 中Ca2+MFI 又显著少于治疗24 个月时（P=0.000）（图2C）；但Treg 中的变化情况相反，治疗24 个月时Treg 中Ca2+MFI 显著多于治疗前（P=0.000），而治疗30 个月时Ca2+MFI 又显著多于治疗24 个月时（P=0.000）（图2D）。

图2 治疗24 个月和30 个月时Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白表达和Ca2+ MFI 的变化 Fig 2 Changes of ORAI1 protein expression and Ca2+ MFI in Teff and Treg 24 and 30 months after treatment

2.3 体外培养的Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白的表达

为了进一步确定体外培养的Teff 和Treg 中是否有ORAI1蛋白的表达，以决定是否可以进行下一步的功能试验，对SLIT 30 个月时的2 种细胞进行了免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜检测，结果发现2 种细胞均有ORAI1 蛋白的表达，其荧光表现为绿色，该蛋白主要位于细胞膜表面（图3）。

图3 体外培养的Teff 和Treg 中ORAI1 蛋白的表达（×200）Fig 3 Expression of ORAI1 protein in Teff and Treg cultured in vitro (×200)

2.4 Lenti-ORAI1 转染对细胞中Ca2+MFI 和培养基中IL-4和IL-10 浓度的影响

为了确定lenti-ORAI1 是否可以转染至Teff 和Treg中，用激光扫描共聚焦显微镜进行观察，发现SLIT 30 个月时的2 种细胞荧光均表现为绿色，Western blotting 检测显示转染后的蛋白表达条带减弱，说明成功转染了目的序列（图4）。接着对Teff 和Treg 中游离Ca2+的浓度进行了检测，结果发现，lenti-ORAI1 转染后，Teff 中Ca2+MFI 显著下降（P=0.004）（图5A），Treg 中Ca2+MFI 也显著下降（P=0.000）（图5B）。此外，lenti-ORAI1 转染后，Teff细胞培养基中IL-4 浓度减少（P=0.009）（图5C），Treg细胞培养基中IL-10 浓度也减少（P=0.000）（图5D）。

图4 Lenti-ORAI1 转染效率验证Fig 4 Validation of transfection efficiency of lenti-ORAI1

3 讨论

免疫治疗的机制包括辅助型T 细胞2（T helper 2 cell，Th2）型免疫反应的抑制、Th1 型免疫反应的上调[9]、CD4+IL-4+T 细胞的凋亡[10]、IL-10+CD4+CD25+T 细胞的增殖[11]和封闭抗体的产生[12]等，但就该治疗方法是否影响T 细胞中ORAI1 蛋白的功能及细胞中游离Ca2+的浓度尚鲜有报道。

先前研究[13]发现ORAI1 位于免疫系统细胞膜表面，后来的研究[14]表明，该分子及其相关通道也存在于其他类型细胞膜。ORAI1 相关通道是一种细胞质中内质网钙储备调控性Ca2+通道[15]，它的激活可以促使细胞外Ca2+大量内流[16]，上调细胞质内游离Ca2+浓度，从而促进各种细胞功能的实施，如增殖分化、细胞脱颗粒以及细胞因子的合成和分泌等[17]。这种通道由ORAI1 及其变构体ORAI2、ORAI3 组成，其中ORAI1 的变异和缺失对其功能影响较大[7]。研究[18]证实，ORAI1 蛋白可以通过促进T 细胞外游离Ca2+的内流，从而升高T 细胞内游离Ca2+浓度，进一步上调T 细胞内Ca2+信号通路，最终促进T 细胞的增殖、合成和分泌细胞因子等功能。

图5 Lenti-ORAI1 转染对细胞中Ca2+ MFI 和培养基中IL-4 和IL-10 浓度的影响Fig 5 Influence of lenti-ORAI1 transfection on Ca2+ MFI in cells and concentration of IL-4 and IL-10 in cell cultures

本研究即是以T 细胞亚群Teff 和Treg 中的ORAI1 蛋白为切入点，探讨SLIT 是否可以通过调控上述2 种细胞中ORAI1 蛋白的表达量来影响其功能，从而影响AR 的炎症状态。结果表明，治疗24 个月时AR 患者PBMC 中Teff 所占CD4+T 细胞百分比显著少于治疗前，而治疗30个月时Teff 所占百分比又显著少于治疗24 个月时，说明随着治疗时间的延长，Teff 的增殖在持续减弱；另外，Treg 在治疗24 个月时所占CD4+T 细胞百分比显著多于治疗前，而治疗30 个月时Treg 所占百分比又显著多于治疗24 个月时，说明治疗时间越长，Treg 的增殖就越多。该结果说明，SLIT 可以减少促进AR 炎症反应的Teff 在血液中的数量，增加抑制炎症反应的Treg 的数量，从而缓解AR 患者的炎症状态。随后，又就SLIT 对Teff 和Treg 中的ORAI1 蛋白的表达进行了检测，结果发现，治疗24 个月时Teff 中该蛋白的表达显著少于治疗前，而治疗30 个月时Teff 中该蛋白的表达又显著少于治疗24 个月时，这说明免疫治疗抑制了Teff 细胞中ORAI1 的表达；对Treg 也进行了相关研究，发现治疗24 个月时Treg中ORAI1 蛋白的表达显著多于治疗前，而治疗30 个月时ORAI1 蛋白的表达又显著多于治疗24 个月时，说明免疫治疗上调了Treg 的ORAI1 的表达。

为了说明ORAI1 蛋白的功能是否受到了影响，接着对2种细胞中游离Ca2+浓度进行了检测。结果显示，Ca2+MFI 的变化与ORAI1 分子在这2 种细胞中的表达趋势基本类似，治疗24 个月时Teff 中Ca2+MFI 显著少于治疗前，而治疗30 个月时Teff 中Ca2+MFI 又显著少于治疗24 个月时；但Treg 治疗24 个月时细胞中Ca2+MFI 显著多于治疗前，而治疗30个月时Ca2+MFI 又显著多于治疗24 个月时。该结果显示，SLIT 可以降低Teff 中ORAI1 蛋白的表达及细胞中游离Ca2+浓度以削弱其促进炎症作用，同时也可以升高Treg 中ORAI1蛋白的表达和细胞中游离Ca2+浓度来增强其抑制炎症作用。

以上研究结果显示SLIT 可对Teff 和Treg 中ORAI1及Ca2+MFI 产生影响，但就这2 种细胞中ORAI1 的表达水平变化是否会影响其细胞内Ca2+浓度变化及随后的功能改变尚待进一步证实。因此又将Teff 和Treg 分别进行体外培养，并用免疫荧光技术进行检测，发现体外培养的这2 种细胞表面均表达ORAI1 蛋白，接着用预先设计并制备好的lenti-ORAI1 感染Teff 和Treg。结果提示，lenti-ORAI1 有效地抑制了2 种细胞的ORAI1 蛋白表达，并导致Teff 和Treg 中Ca2+MFI 浓度降低。接着又分别对这2种细胞培养基上清液中的细胞因子IL-4 和IL-10 进行了检测，发现其浓度也显著减少，这说明ORAI1 蛋白的表达降低导致了Teff 分泌IL-4 和Treg 分泌IL-10 的功能减弱。进一步证明了SLIT 对Teff 和Treg 中ORAI1 的表达及Ca2+MFI 产生的影响，最终导致了2 种细胞功能的改变。IL-4 主要由肥大细胞和Th 细胞合成和释放，该细胞因子可以诱导B 细胞的生长、发育，并促进B 细胞产生和分泌IgE；同时，IL-4 也可以诱导Th 细胞向Th2 细胞的分化，因此IL-4 在AR 的发病机制中起着重要的作用[19]。IL-10 主要由Treg 产生和释放，该细胞因子可以抑制Th 细胞的增殖和Th2 细胞分泌Ⅱ型细胞因子（如IL-4、IL-5 和IL-13 等），从而抑制AR 的炎症反应[20]。本研究中，Teff 的ORAI1 表达减少，细胞功能减弱，提示其促进炎症的功能也减退；而Treg 的ORAI1 表达增多，细胞功能相应增强，提示其抑制炎症的能力在增强。因此，本研究提示，SLIT 不仅可以抑制Teff 增殖，同时促进Treg增殖，也可以通过上调Treg 中ORAI1 蛋白的表达或下调Teff 中ORAI1 蛋白的表达来调控变应性炎症的严重程度。

总之，本研究表明，SLIT 后AR 患者PBMC 中Teff所占CD4+T 细胞百分比逐渐减少，而Treg 逐渐增多；Teff 中ORAI1 蛋白和Ca2+的浓度也逐渐减少，而Treg 中逐渐增多；体外培养的这2 种细胞均表达ORAI1 蛋白，而且在lenti-ORAI1 转染后，2 种细胞中Ca2+MFI 和培养基中IL-4 和IL-10 的浓度均降低。上述结果显示SLIT 可以通过调节ORAI1 蛋白的表达而控制Teff 和Treg 细胞的功能。但是SLIT 的治疗机制还有很多方面尚未阐明[21]，仍需要进一步研究。

参·考·文·献

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