出芽短梗霉发酵制备聚苹果酸研究

何太波，袁恺，周卫强，陈博，卢宗梅，周勇，李义,5，佟毅,5，彭超*

（1.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209；2.中粮生物科技（北京）有限公司，北京 102209；3.营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209；4.中粮生物科技股份有限公司，安徽蚌埠 233010；5.玉米深加工国家工程研究中心，吉林长春 130033）

聚苹果酸是一种以苹果酸为唯一单体并通过酯化聚合而成的新型聚酯类高分子材料，已经被开发用于生物医用材料、化妆类产品、药物载体等极具市场前景的生物活性材料的生产。聚苹果酸主要有α、β、γ 3种结构，其中通过微生物法制备所得的聚苹果酸均为β型[1]。图1所示为苹果酸以及3种聚苹果酸的化学结构式[2]。

图1 苹果酸与聚苹果酸的化学结构

目前，聚苹果酸合成途径主要有两种。化学合成法研究起步早，工艺及生产路线成熟，通过流程控制可以得到α、β、γ任意构型的聚苹果酸。但是化学合成制备材料来源单一、设备要求严格、能耗大，无法满足绿色制造的要求。微生物发酵法制备的聚苹果酸分子量高、产物纯度高，且该方法使用可再生资源，符合绿色环保理念，吸引了国内外众多研究人员的注意力[3]。因此，围绕近年来出芽短梗霉合成聚苹果酸的实验报道，从已开发的各种发酵调控、培养基优化及发酵条件优化等相关方面进行论述，并希望这些研究方法和改进措施能够为微生物发酵法制备聚苹果酸的大规模工业化生产与应用提供理论指导。

1 微生物法产聚苹果酸研究现状

1.1 聚苹果酸生产方式

与化学法制备聚苹果酸相比，微生物发酵法利用微生物将葡萄糖、淀粉等可再生资源直接转化为聚苹果酸，再经下游工序处理后即可得到聚苹果酸纯品。表1详细列举了分别通过化学制备和微生物制备聚苹果酸存在的优势和不足。从表中可以看出，微生物发酵法制备聚苹果酸具有可观的前景：（1）微生物发酵法制备聚苹果酸使用可再生资源，来源广、资源丰富；（2）微生物发酵法反应条件温和、对环境污染小；（3）微生物发酵法只可以制备β型聚苹果酸，产物纯度高，同时分子量高，有利于后期开发利用[2]。

1.2 聚苹果酸生产菌株

1969年，Shimada等人[4]从圆弧青霉中分离得到一种具有抑制蛋白酶活性的酸性高分子化合物，经鉴定后确认是聚苹果酸。1989年，Fischer等人[5]在黏菌的代谢产物中也发现了聚苹果酸的存在。后来短梗霉[6-7]、出芽短梗霉[8]、环状青霉[4]和多头绒泡菌[5]等菌株都被报道可以用于发酵制备聚苹果酸。在用于制备聚苹果酸的微生物菌株中，出芽短梗霉不仅形态稳定，易于实现发酵过程中的有效调控，其合成聚苹果酸的能力也高于其他菌种[9-10]。

聚苹果酸合成能力仅次于短梗霉属的是黏菌变形体，如多头绒泡菌。对多头绒泡菌合成聚苹果酸的研究多集中在合成及代谢调控方面[11]，发酵法制备方面的研究不多。目前，利用黏菌发酵合成聚苹果酸多是采用Lee等[12]在1999年建立的原质团细胞发酵的方法。该方法中菌株M3CVII（ATCC204388）培养6 d后聚苹果酸的产量可以达到2.7 g/L。2000年，该研究组用非生长型的黏菌原质团细胞发酵合成了聚苹果酸，使聚苹果酸的合成和黏菌的生长解离开来，从而实现了低生物量情况下高聚苹果酸产量的合成。Willibald等[13]通过向多头绒泡菌中注射14C标记的L-苹果酸，确定了聚苹果酸的合成路径，同时考察了KCN、砷酸盐、Desulfo CoA、ATP类似物等物质对聚苹果酸合成的影响。Pinchai等人[14]鉴定出一种调节聚苹果酸水平的蛋白质NKA48，但是没有证据证明该多肽是聚苹果酸合成酶的转录产物。对已分离合成聚苹果酸的生产菌株进行总结，见表2。

表1 聚苹果酸合成途径的比较

1.3 出芽短梗霉合成聚苹果酸的代谢途径

聚苹果酸由L-苹果酸单体聚合而成，通过增加代谢中间产物或添加相关酶的抑制剂可以促进或削弱其合成转化效率。Liu等[28]在研究出芽短梗霉合成聚苹果酸途径时，发现添加三羧酸循环（TCA循环）和乙醛酸循环的强抑制剂三氟乙酸会降低聚苹果酸产量。当增加TCA代谢中间产物丁二酸或苹果酸时可减弱三氟乙酸的抑制作用。例如，当添加马来酸和丙二酸时，琥珀酸脱氢酶受抑制，琥珀酸转化为延胡索酸节点受阻，可导致TCA循环中柠檬酸到琥珀酸的中间代谢物积累，而延胡索酸到草酰乙酸之间的代谢产物降低，从而诱导累积的异柠檬酸经乙醛酸循环分流至苹果酸，导致聚苹果酸的合成反而增加，说明聚苹果酸合成与乙醛酸通路异柠檬裂解酶和苹果酸合成酶有关。乔长晟等[29]通过代谢通量分析及关键酶活性的测定发现丙酮酸羧化途径及乙醛酸途径是合成聚苹果酸的主要途径，因此在发酵过程中，通过代谢调控增加丙酮酸羧化途径或在丙酮酸节点进行靶点改造，减少丙酮酸流向其他途径造成碳骨架的流失，有利于聚苹果酸的合成。程若东等[30]研究发现三氟乙酸可以抑制菌体生长和聚苹果酸产生，发酵过程中添加丙二酸与顺丁烯二酸，关键酶的活性增高，A.pullulansBS24生产聚苹果酸的途径可能与TCA循环和乙醛酸循环两个途径有关。

2 出芽短梗霉发酵法产聚苹果酸合成条件优化

目前，出芽短梗霉发酵制备聚苹果酸的优化主要集中在菌株的选育、培养基优化和发酵条件优化。

2.1 菌株的选育

出芽短梗霉发酵制备聚苹果酸获得高产菌株的方法主要有3种，分别是菌株筛选、菌株诱变和菌株代谢工程改造。徐玲芬等[25]从树皮、树叶和树的分泌物以及花中经分离、初筛、复筛得到一株出芽短梗霉菌。以葡萄糖为碳源、发酵培养基中添加30 g/L的CaCO3、0.5 g/L的玉米渣液，置于摇床 25 ℃、220 r/min条件下发酵7 d，聚苹果酸的浓度达到26.23 g/L。李睿颖等[31]通过紫外线诱变研究发现，该菌株最佳诱变时间为150 s，采用甘氨酸平板筛选出产量较高的菌株，且连续重复传代后菌株遗传稳定性无明显异常。随后，研究者又发现在适合时间段添加30 g/L的CaCO3可以有效中和发酵产酸，利于菌体生长。试验结果表明：出芽短梗霉的最佳生长温度为30 ℃，最佳产酸温度为25 ℃，最佳接种量为8%。乔长晟等[32]通过紫外和氦氖激光复合诱变后筛选出一株正向突变的出芽短梗霉菌株，以丁二酸、柠檬酸为唯一碳源，其摇瓶产量为12.62 g/L，较出发菌株聚苹果酸产量提高了2.97倍。

表2 聚苹果酸生产菌株

2.2 培养基优化调控

出芽短梗霉发酵制备聚苹果酸可以从两个方面进行培养基优化。其一是能够有效地合成产物。其二是降低发酵成本，使得聚苹果酸市场竞争力更强。对聚苹果酸合成的影响因子较多，主要包括氮源、碳源、表面活性剂及CaCO3添加量等。

2.2.1 碳源、氮源的影响

据文献报道，除了发酵生产中最常用的葡萄糖、淀粉、麦芽糖等碳源外，一些生物质也被用于聚苹果酸的生产。Naoki等[33]从日本各地采集的木质标本中分离到Aureobasidiumsp. A-91，以葡萄糖为碳源，培养基中加入 30 g/L 的 CaCO3，25 ℃摇床培养 7 d，聚苹果酸的浓度达到47 g/L；Timothy等[34]经过预碱性H2O2处理的小麦秸秆，在含有5%的小麦秸秆发酵液中添加3% CaCO3，可产生23.5 g/L的聚苹果酸。同样的，经过预处理的部分农作物可以用于生产聚苹果酸，通过降低发酵物料的成本从而降低聚苹果酸的生产成本；Cheng等[16]报道了采用大豆制品加工的副产物大豆皮和大豆糖蜜发酵生产聚苹果酸，大豆糖蜜可无需经过酶解预处理步骤而直接被A.pullulansZX—10利用，原因是A.pullulans中含有编码α-半乳糖苷酶和β-呋喃糖苷酶的基因并能表达，从而使A.pullulans直接分解利用大豆低聚糖。Wei等[17]研究了甘蔗糖蜜对发酵产生聚苹果酸的影响，甘蔗糖蜜已经含有充足的氮源支持细胞生长，任何其他氮源都将减少聚苹果酸的产生。结果发现，仅仅采用稀释后甘蔗糖蜜进行发酵而无需添加其他额外营养物质即可满足发酵需要，在5 L发酵罐中进行的分批补料发酵中，聚苹果酸产量达到116.3 g/L。

微生物发酵的氮源多数为蛋白胨、尿素、氯化铵和丁二酸铵等。靳挺等[35]采用丁二酸作为氮源时聚苹果酸产量得到提高，实验结果表明：最佳氮源浓度丁二酸铵为3 g/L，此时聚苹果酸的产量最大，达到16.58 g/L。

程媛嫒等[36]采用响应面分析法对出芽短梗霉菌发酵制备聚苹果酸的培养基进行优化，通过最陡爬坡实验、中心复合实验设计及响应面分析获得了最适发酵培养基。优化后，3种显著影响因素的最佳浓度分别为葡萄糖 110.91 g/L、丁二酸铵 3.66 g/L、碳酸钙 45.30 g/L，聚苹果酸的浓度为 41.6 g/L，对比优化前的20.74 g/L提高199%。李睿颖等[37]使用5 L发酵罐试验，得到最佳种子培养基配方为80 g/L葡萄糖、4 g/L KH2PO4、3 g/L 丁二酸铵、1 g/L 丁二酸、1 g/L MgSO4·7H2O、0.07 g/L ZnSO4·7H2O、3 g/L 玉米浆粉和 30 g/L CaCO3（单独灭菌），转速为 180 r/min。发酵 24 h 后加入 0.44 mmol/L 的曲拉通，发酵 124 h，可收集聚苹果酸的总量达到318 g，优化后产量提高46.8%，整个发酵时间延长，减少种子罐培养，节省发酵成本。

2.2.2 添加CaCO3和表面活性剂的影响

出芽短梗霉合成聚苹果酸培养基中加入CaCO3后，在丙酮酸羧化酶的作用下，草酰乙酸的合成量会增加，其中一部分进一步还原生成L-苹果酸，一部通过苹果酸-天冬氨酸穿梭进入TCA循环，防止草酰乙酸的过量积累造成代谢上的不平衡[27]。赵廷彬等[38]研究发现，不同表面活性剂对出芽短梗霉生长和聚苹果酸制备的影响各不相同。例如，添加吐温80后，其最佳添加量为2 g/L，聚苹果酸产量为31.36 g/L，较对照组提高了30.5%。

2.3 发酵条件优化

微生物发酵过程主要是在微生物细胞作用下所进行的系列串联生物反应过程。通过改变温度、pH等条件可以实现对微生物发酵代谢的控制，从而增加目标产物的积累。

2.3.1 改变溶氧的影响

出芽短梗霉是一类与酵母有密切关系且高耗氧的真菌，发酵过程中必须提供充足的氧气以维持菌体的生长和代谢产物的形成。Xia等[39]报道了采用分阶段溶氧控制策略可以实现聚苹果酸的高浓度积累。通过5 L发酵罐在10%～90%饱和度范围内恒定溶氧，将溶氧在72 h从30%的饱和度转变为70%饱和度的溶氧控制策略，以有效提高聚苹果酸生产菌株的活性，聚苹果酸最大浓度为118.6 g/L，产率大大提高。由此可见，改变溶氧能显著影响菌株对碳源的利用，溶氧增大时，碳源的利用速率和利用率都增大，维持在一定比例更有利于聚苹果酸的产量。

2.3.2 pH的影响

出芽短梗霉适合在酸性环境中生长，但pH偏低也会影响聚苹果酸的合成，选择适合的pH值也会提高聚苹果酸的产率。目前研究发现，培养基初始pH值为4.0～6.0时，有利于聚苹果酸的合成；当pH 5.0～6.0时，是菌株的最佳产聚苹果酸环境[27]。靳挺等[35]控制发酵初始pH为5.5时，聚苹果酸的产量达到 16.58 g/L。

2.3.3 调节温度的影响

程若东等[30]对出芽短梗霉积累聚苹果酸途径及调控进行了细致研究，开发出了双阶段控温法实现了菌株高产量的目的。前24 h最适生长温度调至30 ℃，24 h至发酵结束控制温度保持在25 ℃，使菌株保持在产酸的最适条件，聚苹果酸产量为45.2 g/L；李睿颖等[31]发现出芽短梗霉在不同温度下会出现不同的代谢情况，于是开发出双阶段控温发酵法提高聚苹果酸产量。发酵前期控制发酵温度在30 ℃，此时菌体主要吸收必要营养物质用于生物量的积累，发酵后期控制发酵温度在25 ℃，菌株由生长阶段转入产酸阶段，经发酵18 h后，聚苹果酸产量达到56.2 g/L。

2.3.4 发酵工艺优化

Toshiaki等[40]向细胞制备培养基中添加CuSO4，发现对于提高细胞活性是有效的，最佳条件为葡萄糖 160 g/L、CaCO3为 40 g/L，30 ℃下发酵 5 d，聚苹果酸的浓度为80 g/L；Zou等[9]通过固定在纤维床生物反应器中的菌体进行分批补料发酵，发酵6 d聚苹果酸浓度为144.2 g/L。在发酵过程优化方面，中国科学院过程工程研究所的万印华等[41]公开了利用A.pullulansipe-1发酵生产聚苹果酸的新工艺。研究人员通过发酵过程中溶氧控制、pH控制，同时结合有机氮、无机氮的交配使用，在7 L发酵罐中发酵4 d，发酵液中聚苹果酸的浓度达到 35.2 g/L。

3 结语与展望

聚苹果酸是一种重要、新型、市场应用前景广阔的生物高分子活性材料。随着环境污染越来越严重以及化学合成法存在的较多弊端，势必逐渐被微生物发酵法替代。尽管出芽短梗霉生产聚苹果酸具有产量高的优势，但其较长的发酵周期以及由此导致的单位时间内产量低的问题限制了其的广泛应用。基于基因测序手段的高产菌株诱变和代谢途径改造将进一步提高出芽短梗霉在聚苹果酸生产上的优势。在现有实验室条件下，通过筛选及改造高产菌株的合成代谢途径等方式提高聚苹果酸发酵产量取得了一定效果，并摸索出低成本的培养原料和稳定可靠的发酵控制工艺，为加快实现微生物发酵法工业生产聚苹果酸提供了参考。