云南省文山壮族苗族自治州首例非洲猪瘟的初步诊断

李碧凤，赵 敏，张立喜，袁正春，张绍卫，卢家彦

（1.文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制中心，云南文山 663000；2.砚山县动物疫病预防控制中心，云南砚山 663100）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性动物传染病。ASF 最早于1921年在肯尼亚首次报道，并从非洲相继扩散到欧洲、美洲和亚洲，2018年首次传入我国，是世界动物卫生组织（OIE）规定的须通报动物疫病，是我国的一类动物疫病。ASF 发病率和病死率可高达100%[1]，且因无有效疫苗和药物治疗，其扩散和流行对养猪产业造成了毁灭性打击，严重困扰养猪业的生产与发展，影响着猪肉产品的安全与供给。

基层兽医实验室是动物疫病防控的技术保障与根基。目前，基层兽医诊断技术主要有临床诊断与实验室检测。基层兽医的临床诊断技术对非洲猪瘟的早期监测与排查具有重要意义。基层兽医分子生物学实验室的有效运转及PCR 检测技术的充分运用，为基层有效预防、控制和扑灭ASF 疫情，维护养猪业健康稳定发展奠定了坚实基础。2017年9 月，文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室建成并投入使用，并首先将分子生物学PCR 检测技术应用于禽流感的监测预警[2]。当前可靠性最佳的ASF 诊断技术是基于核酸检测的PCR 和定量PCR 技术[3]。2019年5月23 日，云南省文山壮族苗族自治州砚山县维摩乡散养户饲养的猪发生疑似ASF 疫情。文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室运用PCR 核酸检测技术结合临床剖检，对该起疫情进行了初步诊断。这是对中心兽医分子生物学实验室管理体系、PCR 检测综合能力的一次考验与检验。总结此次文山州首例ASF 病例的紧急检测工作经验，可为发挥基层兽医实验室在防控ASF 等重大动物疫病中的作用提供帮助。

1 材料与方法

1.1 临床观察与剖检

赴现场向养殖户询问疫情发生情况、病猪临床表现。对一饲养户养殖的2 头白毛家猪，另一户养殖的2 头黑毛家猪，共4 头病死猪进行剖检。

1.2 PCR 检测

1.2.1 试剂与仪器设备 （1）PCR 试剂：PremixTaq（TaKaRa）、磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒（BioTeke）、无DNase/RNase 水（PCR 级别）。（2）引物：由云南省动物疫病预防控制中心提供。扩增ASFVVP72基因长度为257 bp 的DNA 片段；使用前，稀释至工作浓度为20 pmol/L，分装后-20 ℃储存。（3）阳性和阴性对照：由云南省动物疫病预防控制中心提供。（4）仪器设备：生物安全柜、高速冷冻离心机、全自动核酸提取仪（BioTeke AU1001）、梯度PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统、超低温冰箱、移液器、高压灭菌器等。

1.2.2 样品处理 病原样品：2 头病死猪均为肥猪（黑、白家猪各1 头）。分别采集2 头病猪的脾脏、淋巴结、肾脏、肺脏共8个样品送检。病原组织样品研磨处理：将病原样品编号，使用高压灭菌的剪刀和研钵，分别取适当组织样品剪碎于研钵中，研磨至匀浆状态，对应编号，保存于2 mL 灭菌离心管中备用。

1.2.3 样品DNA 提取 将离心管中的组织匀浆样品，对称放置于冷冻离心机，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min；每个样品取200 µL 上清液至磁珠法病毒DNA 提取试剂盒中，按试剂盒要求加入25 µL酶，最后放入全自动核酸提取仪中，设置DNA 提取程序，启动全自动核酸提取仪，提取病原样品DNA；程序运行结束后，将提取的核酸保存于-80 ℃备用。

1.2.4 PCR 体系配置 在灭菌的1.5 mL 离心管中，制备以下符合试验样本量（包括阳性、阴性对照等）的PCR 反应混合物（23 µL）：无DNase/RNase 水9.5 µL、PremixTaq酶12.5 µL、正 向引 物PPA-1（20 pmol/L）0.5 µL、反向引物PPA-2（20 pmol/L）0.5 µL。配置步骤：将23 µL PCR 反应混和液加入到0.2 mL PCR 管中，再将2 µL DNA 模板加入到PCR 管中，另设立阳性、阴性对照；每管加入2 µL 模板后，密封反应管，瞬时离心；将所有PCR 管放在PCR 仪中进行扩增。

1.2.5 PCR 扩增条件 50 ℃ UNG 酶孵育2 min，95 ℃Taq酶激活10 min；95 ℃ DNA 变性15 s，62 ℃引物退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延长7 min。

1.2.6 凝胶电泳及成像 分别取7 µL 混匀的PCR产物加入到1×TAE 缓冲液配制的2%琼脂糖凝胶中电泳30～40 min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。

2 结果

2.1 临床症状与剖检

经向养殖户询问得知，猪病死前2～3 d，有厌食、喜卧、疲惫以及偶有呕吐等症状。对4 头病死猪临床观察发现，病死猪体表均出现紫色瘀斑（图1）。剖检发现，脾脏异常肿大（大5～10 倍），颜色发黑，质脆易碎（图2）；肺脏肿大，肾脏肿胀明显、色淡，有少量出血点（图3）；胸腔、心包腔内有积液。

图1 病猪体表出现紫色瘀斑

图2 病死猪脾脏异常肿大、发黑质脆

图3 病变的肺脏、肾脏

图4 PCR 检测结果

2.2 PCR 电泳

PCR 扩增结果显示，8个样本中有7个样品在257 bp左右有特异性扩增条带，与阳性对照一致（图4），4 号（肺脏）样品无特异性扩增条带。

3 讨论

病死猪体表出现紫色瘀斑，脾脏异常肿大等均符合典型ASF 症状；8个样本中，有7个PCR检测出现ASFV 的特异性扩增条带。由此，判断该病死猪疑似感染ASFV。随后按有关要求送样至云南省级动物疫病预防控制中心经实验室复核。截至2019年5 月25 日疫情发布，相关养殖户存栏生猪104 头，发病49 头，死亡48 头。疫情发生后，当地已按照要求启动应急响应机制，采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等应急处置措施，对全部病死猪和扑杀猪进行无害化处理。同时，禁止所有生猪及其产品出入封锁区。

本次疫情是文山壮族苗族自治州首例ASF 疫情。这次疫情考验了文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制系统的“防控作战”能力与建设情况，也检验了文山少数民族自治区基层兽医人员的专业技能与基本功。目前，文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室配备普通PCR 检测设备，PCR 试剂、引物均与云南省动物疫病预防控制中心要求一致，且检测技术人员均经过省动物疫病预防控制中心的专业指导与培训，实验室已通过全省ASF 检测能力比对。本次样品的ASFV 检测，从样品的接收、处理、核酸提取至PCR 扩增及电泳结果上报，均有条不絮地按实验室内部操作程序与质量管理体系进行，是中心兽医分子生物学实验室建成以来一次紧急检测的成功案例。

快速可靠的检测方法对于及时诊断和预防ASF至关重要[4]。基层兽医人员将临床诊断技术[5]与可靠的分子生物PCR 检测技术相结合，提高了基层兽医对ASF 等动物疫病早期诊断、预防与控制的科学性。诊断方法中的实验室检测是确诊ASF 的重要依据[6]。基层兽医实验室开展ASF PCR 初步检测，对于加强ASF 监测预警，及时发现ASFV感染和疑似感染疫情具有重要意义。此次ASF PCR 检测诊断为砚山县动物疫控中心做好ASF 疫情处置准备工作奠定了基础，为及时开展ASF 防控工作争取了宝贵时间。PCR 检测技术在基层兽医实验室的运用增强了ASF 等动物疫病防控工作的主动性和目的性，为科学评估疫情风险提供了技术支持。总结本次ASF PCR 检测工作发现，兽医分子生物学实验室的常规PCR 检测存在耗时长、试验过程产生的污染物易导致实验室核酸污染及实验室生物安全等问题。建议基层实验室购置快速、准确的荧光定量PCR 仪，以缩短检测时间，减少污染，提高检测结果的准确性。今后，应逐步提高基层兽医实验室检测技术，继续充实ASF 等重大动物疫病检测、监测的资金投入，完善中心兽医实验室的硬件设施，重视“软件”建设及管理[7-8]，加强兽医分子生物学实验室生物安全防控，充分发挥基层兽医分子生物学实验室在动物疫病防控中的作用。