基于GC-MS技术对盐胁迫小麦小分子代谢物的研究

肖丽君， 陈 乾， 牟美睿， 贲蓓倍， 杨仁杰， 刘海学

(1.天津农学院农学与资源环境学院, 天津 300384； 2.天津农学院园艺园林学院, 天津 300384；3.天津农学院工程技术学院， 天津 300384)

我国盐碱地总面积约为0.99亿hm2,随着对土地的不合理开发，土地盐碱面积日益增加[1]。选育耐盐品种，合理开发盐碱地，对土地资源的合理利用具有重要的意义。目前，利用GC-MS进行代谢组学分析已成为研究生命体小分子代谢物的主流技术，在水稻[2-5]、玉米[6-9]、大麦[10-12]等作物领域得到广泛应用，Kui Kang等[2]研究发现，褐飞虱以破坏水稻内宿主细胞代谢途径的方式使水稻遭受虫害，从而找到抗褐飞虱的水稻品种。Venkatesh等[6]研究发现，玉米的代谢物与农艺性状有较强的相关性，并以此进行品种分类。Jianbin Zeng等[10]研究发现，低钾胁迫下大麦的小分子代谢物具有一定的变化。目前，关于小麦小分子代谢物的相关分析研究较少。

GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectometer)全称为气相色谱-质谱联用技术，它是在代谢组学之中分析小分子代谢物的主要方法之一。其原理是：不同物质在色谱柱中的移动速度不同导致混合气体分离状况不同，从而在质谱的离子源的作用之下形成质荷比不同的碎片离子，经系统识别后得到色谱图[13]。GC-MS技术是发展比较成熟的分析技术，它的优点是鉴定小分子代谢物简单、容易操作，并且分辨率、灵敏度以及重现性都比较好，至今它仍然作为分析代谢组学的主要手段之一[14]，它的局限性在于不能分析大分子代谢物、难挥发性或者热性不稳定的物质[15]。

小麦品种“辽春17号”具有高抗倒伏、耐密植、产量高等优良品质[16]，但对该品种小麦的耐盐性及盐胁迫下小分子代谢物的变化规律研究较少。本试验利用GC-MS技术对不同浓度盐胁迫下的小麦叶片进行小分子代谢物分析和代谢通路分析，探索小麦内部的生理变化情况，为耐盐品种的选育提供参考方向，为后续代谢组学小分子代谢物的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为辽春17号小麦种子，由天津农学院作物抗逆的机理及遗传改良国际联合研究中心提供。N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)∶三甲基氯硅烷(TMCS)=100∶1(麦克林，中国上海)、盐酸甲氧胺(SIGMA，美国)、乙腈(色谱纯，康科德，中国天津)、异丙醇(色谱纯，天昊化工，中国天津)、吡啶(色谱纯，迈瑞达科技，中国北京)、正庚烷(色谱纯，津科，中国天津)、十一烷(色谱纯，光复，中国天津)、Hoagland营养液(H 353，phytotech，美国)。盐酸甲氧胺吡啶溶液：40 mg·mL-1溶于吡啶、内标物十一烷：20μg·mL-1溶于正庚烷。

1.2 试验仪器

美国Aglient气相色谱-质谱联用仪(7890 A-5975 C)、气相毛细管色谱柱(HP-5 MS)、自动进样器(7683 B-Series)。常州凯航水浴锅(HH-2)，德国eppendorf离心机(5920 R)，美国Reeko氮吹仪(Auto EVA)和氮气发生器，苏州玻西瓦尔超声波清洗仪(TZL 5005)，宁波江南仪器厂人工气候箱(RXZ型)。

1.3 试验方法

1.3.1材料的培养

将小麦(辽春17号)种子用75%的酒精消毒5 min，超纯水清洗4～5遍，25 ℃室温下浸种8 h。挑选饱满、充实的种子均匀放置于内衬灭菌纱布的培养皿内，每个培养皿内放置25粒种子，放于人工气候箱培养，温度25 ℃、湿度50%，24 h避光培养。出芽后，开启光照强度8 000 lx，12 h，营养液浇灌。生长至第9天，使用不同浓度的NaCl进行胁迫，胁迫3 d后取样备用。

1.3.2材料的处理

参照王玲[17]、张晓倩[18]的方法，液氮研磨，取150 mg，加入乙腈、异丙醇与水等体积混合的提取剂1 mL，超声提取4 ℃，35 min。10 000 r·min-1离心1 min，取上清液150μL氮气吹干，加入盐酸甲氧胺吡啶溶液10μL，30 ℃水浴，90 min。再加入MSTFA与TMCS混合液30μL，37 ℃水浴30 min。加入内标物十一烷，混匀，过0.22μm有机针孔滤膜，GC进样小瓶接收，等待利用GC-MS进行检测。

1.4 仪器参数与数据分析

GC-MS分析参数：气相毛细管色谱柱(HP-5 MS：30 m×250μm×0.25μm)、梯度程序：0～1 min，60 ℃；1～11 min，60～210 ℃；11～17 min，210～270 ℃；17～20 min，270～280 ℃；20～28 min，280 ℃。载气：氦气,流速64 mL·min-1,进样方式：GC自动进样器进样，进样量0.5μL。使用SPSS 22.0软件、MetaboAnalyst 4.0平台及Excel软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 小分子代谢物的主成分分析

将不同浓度试验处理进行编号(表1)，主成分(PCA)的分析结果中提取前3个主成分，贡献率分别为27.26%、22.41%、21.23%，绘制三维得分图(图1)，与未进行胁迫的1号相比，2,3,4号与1号空间距离较近，说明与对照相比差别不显著，5,6,7号与1号空间距离较远，说明与对照相比差异较大。因此，与对照相比,在NaCl胁迫浓度为200、250 mmol·L-1和300 mmol·L-1条件下，小分子代谢物均呈现出一定程度的差异性。

表1 NaCl胁迫浓度及对应编号

编号NaCl浓度/(mmol·L-1)1025031004150520062507300

利用方差极大法旋转因子载荷矩阵得到载荷图(图2)，结果表明，主成分1与缬氨酸、异亮氨酸、丁二酸、苏糖酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸及赖氨酸高度正相关。主成分2与丙氨酸、尿素、脯氨酸、核糖、阿拉伯吡喃糖、反乌头酸、色氨酸及蜜二糖高度正相关，而与2-戊烯酸和古洛糖酸高度负相关。主成分3与丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、核糖和邻苯二甲酸高度正相关，而与天冬酰胺、木糖及吡喃半乳糖高度负相关。结果表明，前3个主成分主要与氨基酸、有机酸及糖类物质具有高度相关性，说明在盐胁迫的过程中，小麦叶片的氨基酸、有机酸和糖类物质显著积累。氨基酸类物质通过合成相应的抗逆蛋白抵御逆境，糖类物质为植物体提供能量，植物体通过积累有机酸来适应逆境胁迫状态[19]。所以小麦的代谢活动比较频繁，被检测出的小分子代谢物个数较多。

2.2 标志性差异代谢物的查找

t检验常用于检验小分子代谢物的差异性，并借此找出标志性的差异代谢物。数据处理后结果如表2所示，经过筛选共检测出53种代谢物。其中，差异显著的代谢物16种，包括氨基酸类代谢物7种(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苹果酸、天冬氨酸、谷氨酰胺)，糖类代谢物3种(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖)，有机酸类代谢物5种(丙酸、丙二酸、丁酸、丙烯酸、邻苯二甲酸)，其他物质1种(吡哌酸)。差异极显著的代谢物7种，包括糖类代谢物2种(半乳糖、葡萄糖)，有机酸类代谢物4种(丙二酸、丁酸、丙烯酸、邻苯二甲酸)，其他物质1种(吡哌酸)。在差异显著的代谢物中，氨基酸类物质所占比重最大，为40.33%(图3)。

图3 各类显著差异的代谢物占比

2.3 小分子代谢物的代谢通路分析

借助MetaboAnalyst 4.0平台对小分子代谢物的代谢通路进行分析得到气泡图(图4)，其中气泡大小代表影响因子大小，气泡越大影响因子越大；颜色深浅代表P值大小，颜色越深P值越小，小分子代谢物积累程度越高[20]。选取影响因子大于等于0.2或-log(p)较大的代谢通路[21,22]，得到与小分子代谢物相关的代谢通路11条：氨酰基-tRNA生物合成通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路，淀粉和蔗糖代谢通路，半乳糖代谢通路，乙醛酸和二羧酸代谢通路，肌醇磷酸代谢通路，酪氨酸代谢通路，异喹啉生物碱生物合成通路，苯丙氨酸代谢通路，色氨酸代谢通路，并标记在图4中。

将代谢通路分析气泡图中P值与影响因子汇成表3，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路最显著，影响因子最大为0.53。其次为异喹啉生物碱生物合成通路，苯丙氨酸代谢通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路。在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路中，有5种被筛选出来的标志性小分子代谢物参与其中(甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、色氨酸、苏氨酸)，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路是通过调节各自的反应机制以适应逆境胁迫带来的影响[23]。异喹啉生物碱生物合成通路中，利用酪氨酸经过一系列反应合成生物碱来抵抗外界不良物质的侵染[24]。苯丙氨酸的反应生成物可以作为植物的保护素来屏蔽外界的破坏物质，抵御逆境胁迫，从而增强抗逆性[25]。相关的小分子代谢物的代谢通路是小分子代谢物在逆境胁迫条件下所必须经历的过程，可以作为植物遭受盐胁迫的判断标准。

表2t检验下小麦小分子代谢物的显著性情况

代谢物t值sig.显著性氨基酸类丙氨酸3.157*0.025缬氨酸2.737*0.041异亮氨酸2.738*0.041脯氨酸3.259*0.022丝氨酸0.0770.941苏氨酸0.7000.515苹果酸3.461*0.018天冬氨酸-3.124*0.026甘氨酸0.0001.000天冬酰胺-0.6470.546谷氨酰胺2.580*0.049苯丙氨酸2.5160.053赖氨酸0.0020.999酪氨酸1.2950.252色氨酸-0.0480.963有机酸类丙酸2.969*0.031丁二酸0.7380.4942-戊烯酸1.3640.231丙二酸-10.862**0.000丁酸-4.216**0.008苏糖酸-0.0290.978丙烯酸-10.108**0.000顺乌头酸1.0300.350反乌头酸-0.0010.999苯丙酸-1.5820.175邻苯二甲酸-4.501**0.006邻苯二甲酸二丁酯0.0001.000十六烷酸-2.3520.065十八烷酸-2.4500.058代谢物t值sig.显著性糖类核糖0.0001.000阿拉伯糖3.652*0.015阿拉伯吡喃糖0.0080.994吡喃木糖0.0280.979果糖2.0610.094吡喃山梨糖1.9310.111呋喃半乳糖0.2840.788吡喃葡萄糖醛酸0.0011.000吡喃葡萄糖1.8340.126吡喃半乳糖2.4240.060塔罗糖0.0030.998古洛糖酸0.0001.000木糖1.2110.280半乳糖-20.954**0.000葡萄糖-26.566**0.000半乳糖醛酸0.0040.997麦芽糖-0.0200.985蜜二糖1.2760.258其他物质尿素1.1190.314硅醇0.0001.000吡哌酸-4.073**0.007甘油0.0030.998甘露醇0.0410.969肌醇1.4420.209

注：“*”表示5%的显著水平，“**”表示1%的显著水平。

图4 代谢通路分析气泡图

表3 代谢通路分析结果

序号代谢通路名称 -log(p)影响因子1氨酰基-tRNA生物合成17.250.092丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢7.140.423甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢5.600.534淀粉和蔗糖代谢4.380.085半乳糖代谢4.240.116乙醛酸和二羧酸代谢2.020.237肌醇磷酸代谢2.020.258酪氨酸代谢1.920.279异喹啉生物碱生物合成1.580.5010苯丙氨酸代谢1.060.4611色氨酸代谢0.470.31

3 讨 论

1) 浓度为200、250 mmol·L-1和300 mmol·L-1的盐胁迫处理组与对照组的小分子代谢物呈现差异性。

2) 经过筛选共检测出53种代谢物，差异显著的代谢物16种(氨基酸类7种、糖类3种、有机酸类5种、其他物质1种)；差异极显著的代谢物7种(糖类2种、有机酸类4种、其他物质1种)。在差异显著的代谢物中，氨基酸类物质所占比重最大，为40.33%。

3) 共筛出11条相关代谢通路，其中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路为主要代谢通路。其次为异喹啉生物碱生物合成通路，苯丙氨酸代谢通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，这些通路都与合成相应的抗逆物质相关，可作为衡量植物是否遭受盐胁迫的评判标准。

小麦(辽春17号)盐胁迫所产生的的代谢物主要为氨基酸类、有机酸类和糖类三大类，此三类代谢物在逆境胁迫下起着至关重要的作用。Steinbrenner等[26]研究表明，芳香族氨基酸可以抵抗外界不良环境施加的影响。Hare等[27]和Li等[28]研究表明，植物在遭遇逆境胁迫后，植物体内会产生脯氨酸、甘露醇、甜菜碱等物质。研究表明，有机酸含量的变化可以作为盐胁迫条件下代谢状况的显著特征，糖类物质的分泌是逆境胁迫下植物为自身提供能量，抵抗逆境胁迫[29-31]。本试验结果与前人的研究结论一致。