烟草种子活力的复合逆境法研究

潘 威， 杨晓东， 杜景诚， 乔 雨， 马文广,2

(1.玉溪中烟种子有限责任公司， 云南 玉溪 653100； 2.云南省烟草农业科学研究院， 云南 玉溪 653100)

烟草种子作为烟叶生产中最基础性的生产资料[1-3]，提高其质量和科技含量是提高烟叶产量和品质的重要手段。目前，烟草种子质量主要通过标准发芽试验的发芽率来检测[4-5]，而发芽率仅代表种子是否具有生活力[6-7]，理想环境下是否能够萌发，不能准确反映种子在复杂育苗环境中实际出苗表现。而种子活力[8-10]是指可衡量高发芽率的种子批在广泛的环境下出苗时不同方面的综合特性，可准确反映种子田间实际表现，以其为检测标准可进一步提升烟草种子质量。复合逆境法(CSVT)是国外发展起来的一种种子活力测定新方法[11]，该法模拟种子出苗过程可能遭遇多重逆境，检测种子逆境下萌发表现，相比其它种子活力测定方法，更符合国际种子检验协会(ISTA)对种子活力的定义，更能体现种子活力全面状态，且方法快速、简便，已有在玉米和小麦种子[12-13]上应用的报道。而国内外烟草种子活力检测方法虽有报道[14-17]，但真正适于企业应用的方法基本没有，也没有关于复合逆境测定烟草种子活力方法的研究报道。本研究模拟国内烟区漂浮育苗过程常见低温、低氧逆境，探索利用复合逆境法测定烟草种子活力可行性，以期为进一步提升烟草种子质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验种子均取自玉溪中烟种子有限责任公司良种库。包括：云烟85(2001-0164)、云烟85(2003-0144)、MS云烟85(2008-0927)、云烟105(2015-0030)、云烟105(2007-0010)、云烟105(2015-0059)、云烟97(2005-0228)、云烟97(2005-0178)、云烟97(2012-0971)、云烟87(2001-0064)、云烟87(2002-0138)、MS云烟87(2014-2882)、MSK 326(2004-0402)、MSK 326(2004-0387)、MSK 326(2013年)共5个品种，15份样品，这些品种每年的全国种植面积合计超过80%以上，具有较高代表性。

1.2 研究地点与方法

1.2.1试验地点

试验均在玉溪中烟种子有限责任公司进行。

1.2.2标准发芽检测

在培养皿中垫置2层滤纸，湿润，滤纸上均匀放置100粒烟草种子，每个批号3次重复，然后将培养皿置于25 ℃培养箱内，每天光照12 h，发芽期间保持滤纸湿润。从第5天开始，每天记录种子发芽数目，以胚根正常、胚轴顶端(子叶)见绿为种子发芽计数标准，统计至14 d。第7天记录种子发芽势，第14天记录种子发芽率，并计算发芽指数，发芽指数=∑(Gt/Tt)(式中：Gt为不同时间的发芽数，Tt为发芽天数)。

1.2.3种子复合逆境试验

取上述供试烟草种子，放入棉布袋中，扎紧袋口，整袋完全浸入水中，25 ℃浸种48 h，促使种子内部各种生化过程启动，同时经历低氧胁迫，然后分别转入5 ℃、2 ℃、1 ℃水中冷浸48 h，取出种子，吸干表面水分，25 ℃下进行标准发芽试验，每个样品3次重复，在5 d、7 d、14 d进行正常幼苗计数，5 d以见绿为计数标准，7 d、14 d以2片子叶展开，幼苗正常为计数标准，分别计算复合逆境处理后种子在5 d、7 d、14 d的发芽百分率，研究种子经历低温、低氧胁迫后的发芽表现。

表1 不同烟草种子标准发芽结果及出苗率

品种 生产年份批号5d发芽势/%7d发芽势/%14d发芽率/%发芽指数出苗率/%MS云烟852001016452.67c79.00b83.33b15.18b52.37c云烟852003014481.00b92.67a95.00a18.33a71.90bMS云烟852008092790.00a96.33a97.67a19.16a90.52a云烟872001006472.67b88.00b89.00b17.10b75.33c云烟872002013872.33b91.67b93.00ab17.80b80.72bMS云烟872014288295.67a98.33a98.67a19.61a90.85a2004040257.00b69.00b73.00b13.66b53.59bMSK3262004038788.00a96.00a97.33a18.99a82.03a2013022992.33a96.00a97.33a19.21a88.24a2005022856.67b78.00b82.67b15.29b64.54c云烟972005017878.00ab88.67ab91.00ab17.57ab80.72b2012097191.67a97.67a99.33a19.43a88.89a2015003085.00a93.33b94.00b18.42b82.68b云烟1052007001085.33a94.67ab96.33ab18.73ab87.91ab2015005990.33a98.00a98.33a19.37a90.85a

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(p≤0.05)。下同。

1.2.4漂浮育苗出苗率检测

由于全国烟区育苗时间、地点不同，育苗期间气候、环境尤其是温度则有一定差异。为保证漂浮育苗实验中设定温度能较好反映烟区实际情况，出苗检测结果具有较高代表性，实验统计了云南、湖北、重庆、四川等烟区近4年来共计180份苗期育苗温度，根据统计分析结果将育苗温度划分为4个时间阶段(00：00—06：00时为8 ℃、06：00—12：00时为20 ℃、12：00—18：00时为25 ℃、18：00—24：00时为12 ℃)。育苗用基质采购于玉溪果木林场，采用595孔漂盘，每孔1粒，育苗过程严格依照《烤烟漂浮育苗技术规程》进行，第22天以2片子叶展开，幼苗正常为判断依据，统计出苗率，出苗率结果作为对应批号种子活力的最终依据。

1.2.5差异显著性分析和回归分析

采用SPSS 17.0软件进行同一品种不同年份(批号)种子间标准发芽结果、出苗率、复合逆境发芽结果的差异显著性分析；利用Excel 2013软件进行标准发芽、复合逆境发芽与出苗率的线性回归分析。

2 结果分析

2.1 标准发芽及出苗率结果

出苗率是反映种子活力高低、质量优劣最直接的依据，所有检测指标都需与之比较，以确定检测方法的可靠性。由表1看出，同一品种3个批号种子发芽势、发芽率、发芽指数均由低到高排列，与对应出苗率呈正相关关系，但发芽势、发芽率均高于其田间实际出苗率，尤其是生产年份较早的种子，如云烟85-0144的7 d发芽势为92.67%，但其出苗率仅为71.90%。同一品种中最早年份种子的发芽势、发芽率、发芽指数与后2个年份种子均存在显著性差异，如MS云烟85-0164的7 d发芽势较0144、0927分别相差13.67%、17.33%，差异达显著水平；而同一品种中后2个年份之间的种子发芽势、发芽率、发芽指数差异均不显著，如云烟85中0144的7 d发芽势与0927仅相差3.66%。这与出苗率分析结果不一致，0144与0927的出苗率相差达到18.62%，差异达显著水平。这种发芽指标的差异分析结果与出苗结果不一致的情况也发生在云烟87、云烟97上。总的来说，发芽势、发芽率、发芽指数等指标与种子实际出苗结果总体趋势一致，但不能准确地反映所有批号种子实际出苗情况，尤其是不能区分出发芽指标接近，但实际出苗表现有较大差异的种子批，无法有效代表种子活力。

表2 不同烟草种子复合逆境处理后发芽结果

品种生产年份批号 5℃处理发芽结果/%2℃处理发芽结果/%1℃处理发芽结果/% 5d7d14d5d7d14d5d7d14dMS云烟852001016417.33c65.33b73.67b64.67b68.00b70.00b17.00c71.00c74.00c云烟852003014469.00b74.00b76.67b66.67b70.00b71.67b81.67b88.00b88.00bMS云烟852008092787.67a90.33a95.33a89.00a91.67a92.00a92.33a94.00a95.00a云烟872001006475.33b79.00b83.00b77.67b79.67b82.67c73.67b80.00b82.00b云烟872002013875.67b78.67b83.67a78.67b83.67b88.00b82.00b87.67b87.67bMS云烟872014288292.67a95.33a95.33a93.33a94.00a94.00a96.33a97.33a96.67a2004040250.00b63.67b64.67b61.67b64.67c67.33c57.67b64.33b63.00bMSK3262004038789.00a89.67a94.33a88.67a89.00b89.33b88.00a93.33a94.33a2013022990.00a89.33a91.00a91.67a91.67a94.33a92.33a94.33a94.67a2005022848.00c68.33c76.00b51.67c65.33b73.00b48.00c64.33c63.00c云烟972005017867.00b81.00b86.67ab69.33b77.00b80.00ab72.00b79.00b80.00b2012097186.33a87.67a90.33a91.00a93.00a94.00a92.33a93.33a94.00a2015003087.00a90.00b91.67b82.33b84.33b84.67b85.33ab93.33ab92.67ab云烟1052007001090.67a93.33ab96.33a86.00b88.67b91.00a80.00b90.00b88.67b2015005992.67a97.67a97.67a93.67a96.00a94.33a95.67a97.00a96.33a

2.2 复合逆境法测定烟草种子活力

2.2.1不同冷浸温度与统计时间下活力测定

复合逆境法先让种子在常温下吸胀48 h，促进生理生化活动启动，再经历低温、低氧浸种48 h，生化活动减缓，酶活降低，恢复理想发芽条件后，低活力的种子萌发缓慢甚至不能萌发，高活力种子则能够更快恢复，正常萌发为健壮幼苗。烟草种子经复合逆境处理后，萌发前期幼苗极小，统计困难，试验选择计数结果可靠的5 d后统计发芽。比较5 d、7 d、14 d活力检测结果，从差异显著性来看，后2个批号出苗率存在显著差异的品种云烟85、云烟87、云烟97，复合逆境处理后第5天、7 d发芽结果均有显著差异，与出苗结果一致，但14 d结果并不理想，如5 ℃、2 ℃下，云烟97-0971与云烟97-0178的14 d发芽均无显著差异，与出苗情况不一致。因此，复合逆境法5 d、7 d发芽结果评价种子活力比14 d更合适。从结果稳定性上分析，生产年份较早、活力较低种子对复合逆境胁迫更为敏感，受影响更大，5 d统计结果不够稳定，如MS云烟85-0164在5 ℃、2 ℃、1 ℃复合逆境下5 d发芽分别为17.33%、64.67%、17.00%，数据变化较大。即便在相同复合逆境处理温度下，活力低的种子在5～7 d发芽结果变化也较大，如5 ℃下，MS云烟85-0164种子5 d发芽仅为17.33%，明显与实际出苗不符，至7 d发芽迅速提高至65.33%。相对来说，不同活力水平的种子在不同温度复合逆境处理后，7 d结果均较为稳定，更适宜用于评价种子活力。

试验采用5 ℃、2 ℃、1 ℃低温浸种胁迫种子，比较3个处理温度结果，相对标准发芽，3个温度复合逆境处理后，同一品种3个批号种子7 d发芽仍是由低到高排列，但受逆境胁迫影响，与标准发芽比较均有所降低，尤其是同一品种中生产年份早，活力低的种子7 d发芽降低明显；而生产年份晚的种子，降低幅度较小，这种变化与出苗率相对于标准发芽结果的变化一致。从差异显著性分析，5 ℃、2 ℃、1 ℃处理下，所有品种7 d 活力检测结果的差异性与漂浮育苗出苗率均基本一致，均能有效区分标准发芽接近而出苗有差异的种子批，因此，最优复合逆境温度的确定还需要比较回归分析结果。

2.2.2不同检测指标与出苗率回归分析比较

如表3所示，5 d发芽势、7 d发芽势、14 d发芽率、发芽指数均与出苗率呈正相关，回归系数R2分别为0.878 2、0.888 0、0.862 2、0.905 7，其中，发芽指数与漂浮育苗出苗率的回归系数最大，发芽势次之，发芽率最差。

比较复合逆境法不同统计时间与出苗的回归系数，5 d发芽与出苗率相关性最低，R2在0.724 1～0.781 3之间；7 d最高，R2在0.829 4～0.908 4之间；而14 d相对7 d则略有降低，说明7 d结果更能代表种子活力，这与差异显著性分析结果一致。分析不同复合逆境温度下种子7 d发芽与出苗率线性回归系数，5 ℃比2 ℃、1 ℃线性回归效果更好，相关性最高，R2达到0.908 4，比标准发芽条件下发芽指数的R2(0.905 7)更高。另外，发芽指数需要每天统计发芽率后计算得出，而复合逆境处理只需统计第7天发芽结果即可，应用在生产实践中可极大缩减工作量与时间。总而言之，烟草种子经25 ℃浸种48 h，5 ℃冷水浸种48 h，25 ℃下进行标准发芽试验，7 d发芽结果与出苗率呈显著相关，可有效代表种子活力，效果优于标准发芽指标。

表3 不同指标与出苗率回归分析结果

检测方法检测指标回归方程回归系数R2标准发芽5d发芽势y=0.8202x+14.010.87827d发芽势y=1.3404x-42.280.888014d发芽率y=1.5257x-61.960.8622发芽指数y=6.4850x-36.790.9057复合逆境法5℃处理5dy=0.5078x+40.6760.72417dy=1.0670x-9.4310.908414dy=1.1860x-23.4850.90182℃处理5dy=0.8203x+14.14700.78137dy=1.0576x-8.18090.888014dy=1.2000x-22.29700.89931℃处理5dy=0.4993x+40.58100.76207dy=0.9877x-5.73360.829414dy=0.9694x-4.35670.8021

3 讨 论

种子活力检测的目的是预测其实际出苗表现，而其出苗表现受种子本身及出苗环境影响。所以，适宜的活力测定方法应考虑可能遇到的播种条件。目前，国内烟草虽多采用棚内漂浮育苗方式育苗，但在春季气候条件下播种，仍时常会遭遇低温逆境，使烟草种子处于一段时间的低温吸水阶段，影响出苗质量。复合逆境法就是模拟种子播种时的不良气候条件，首先在适温条件下浸种，促进种子内部活化，萌发启动，随后种子遭遇低温，加之持续浸种带来的缺氧环境，低活力的种子细胞膜完整性差，内部活性物质在浸泡中会损失，细胞膜系统也会优于低温浸种逐渐丧失生化控制功能，RNA、蛋白质合成也会显著降低，出现种子生理损伤，最终表现为恢复理想萌发环境后，仍不萌发或幼苗弱小，而高活力的种子在遭遇逆境后所受影响较小，恢复理想环境后，仍能较好较快生长发育。因此，复合逆境活力检测结果相对于理想环境下的标准发芽指标，能更好反映烟草种子复杂气候环境下漂浮育苗实际结果。

4 结 论

研究以国内种植面积较广的云烟87、云烟85、MSK 326、云烟97、云烟105共计15个批号烟草种子为材料，探索了复合逆境法测定烟草种子活力的最优条件及效果：

1) 不同逆境温度比较，5 ℃处理后7 d发芽与种子出苗率回归系数比2 ℃、1 ℃更高，且更易实现。

2) 在种子活力计数时间和标准上，7 d发芽与出苗率回归系数比5 d、14 d更高，相关性更好，且能有效区分标准发芽接近而实际出苗差异较大的种子批。总之，烟草种子经25 ℃快速吸胀48 h后，在5 ℃低温浸种48 h，在标准发芽条件下7 d测定发芽种子数，可有效代表烟草种子活力。与标准发芽结果比较，回归系数高，相关性更好。