组织因子及其可溶性剪切体在结肠癌组织中的表达及临床意义

胡丽超　李佳丽　杨占甲　王敬真　程自想　高凯

[摘要] 目的 探討组织因子（membrane-bound full-length，flTF）及其可溶性剪切体（alternatively spliced tissue factor， asTF）在结肠癌组织中的表达，并分析其临床意义。方法  采用RT-PCR方法检测2015年7月—2018年12月方便选取在郑州人民医院行结肠癌切除术的42例患者的结肠癌组织及癌旁正常组织中flTF及asTF mRNA表达水平，并分析与肿瘤转移力的影响。结果 结肠癌组织中flTFmRNA表达水平[5.53（4.80～13.32）]高于癌旁组织[0.36（0.02～1.21）]，差异有统计学意义;结肠癌组织中asTFmRNA表达水平[1.26（0.74～2.02）]高于癌旁组织[0.11（0.06～0.57）]，差异有统计学意义（P<0.05）。伴有远处转移的结肠癌组织中flTF的表达水平[8.64（5.98～12.71）]高于无转移的结肠癌组织（2.25（1.57～5.32）、有远处转移的结肠癌组织中asTF表达水平[5.19（4.96～7.84）]高于无转移组（0.67（0.23～1.08）），差异有统计学意义（P<0.05）。结论 flTF及asTF在结肠癌中组织中异常高表达，并与结肠癌侵袭与转移相关。

[关键词] 组织因子;可溶性剪切体;结肠癌

[中图分类号] R735          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2020）04（c）-0010-03

Expression and Clinical Significance of Tissue Factor and Its Soluble Spliceosome in Colon Cancer

HU Li-chao， LI Jia-li， YANG Zhan-jia， WANG Jing-zhen， CHENG Zi-xiang， GAO Kai

Department of Blood Transfusion， Zhengzhou People's Hospital， Zhengzhou， Henan Province， 450003 China

[Abstract] Objective To investigate the expression of tissue factor （membrane-bound full-length （flTF） and its alternative spliced tissue factor （asTF） in colon cancer tissues， and analyze its clinical significance. Methods RT-PCR was used to detect the expression levels of flTF and asTF mRNA in colon cancer tissues and adjacent normal tissues of 42 patients who were conveniently selected and underwent colon cancer resection at Zhengzhou People's Hospital from July 2015 to December 2018. Influence of transfer force. Results The expression level of flTFmRNA[5.53（4.80～13.32）] in colon cancer tissues was higher than that in adjacent tissues[0.36（0.02～1.21）]， and the difference was statistically significant（P<0.05）; the expression level of asTFmRNA in colon cancer tissues[1.26（0.74～2.02）]， higher than adjacent tissues [0.11（0.06～0.57）]， and the difference was statistically significant. The expression level of flTF [8.64 （5.98 ～ 12.71）] in colon cancer tissues with distant metastasis was higher than that in colon cancer tissues without metastasis [2.25 （1.57～5.32）] and colon cancer tissues with distant metastases. The level （5.19 （4.96～7.84）） was higher than that in the non-metastatic group （0.67 （0.23～1.08））， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion flTF and asTF are abnormally highly expressed in colon cancer tissues， and are associated with colon cancer invasion and metastasis.

[Key words] Tissue factor; Soluble spliceosome; Colon cancer

组织因子（tissue factor， TF），又称组织凝血活酶或凝血因子III，作为外源性凝血途径的启动因子参与机体凝血过程，此外作为凝血系统中唯一在细胞表面的跨膜糖蛋白，具有受体特性并发挥许多非凝血功能。研究发现组织因子常异常表达于多种肿瘤细胞表面，跨膜的全长组织因子（membrane-bound full-length，flTF）和亚型异常剪接组织因子（alternatively spliced tissue factor， asTF）均可影响肿瘤多种病理过程，如肿瘤相关血管生成、肿瘤相关血栓、肿瘤增值及迁移等[1]。该课题组前期结果发现结肠癌细胞株SW620高表达flTF，通过激活细胞表面PAR2受体促进结肠癌细胞的增值和迁移[2]，该研究方便收集2015年7月—2018年12月在郑州人民医院行结肠癌切除术的42例患者的结肠癌组织及癌旁正常组织，继续探讨flTF和asTF在结肠癌组织中的表达情况及对肿瘤侵袭和转移的影响，报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

方便收集在郑州人民医院行结肠癌切除术的42例患者的结肠癌组织及癌旁正常组织（>3 cm），所有标本均经病理学确诊，42例患者年龄36～67岁，平均年龄（47.7±8.5）岁，其中腺癌25例，鳞细胞癌12例，其他5例;发生远处转移者10例，未发生转移者32例。

1.2  试剂

TRIzol购自Invitrogen公司，RIPA购自碧云天生物技术有限公司，逆转录试剂盒购自Toyobo公司，实时荧光定量PCR试剂盒购自康为世纪有限公司，ECL显色试剂、PVDF膜购自Millipore公司。

1.3  方法

总RNA抽提及RT-qPCR的扩增：取100 mg结肠癌组织和癌旁组织分别加入1 mlTrizol试剂，彻底匀浆，按照试剂说明书提取总RNA，应用逆转录试剂盒合成cDNA，CFX96荧光定量PCR分析仪（美国Bio Rad公司）检测flTF、asTF及β-actin mRNA表达水平。引物序列见表1，目的基因相对表达量为目的基因拷贝数与β-actin拷贝数的比值。

1.4  统计方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用（x±s）表示，正态分布数据两组间比较采用t检验，计数资料[n（%）]行χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  结肠癌组织及癌旁组织中flTF mRNA的表达

采用实时定量PCR检测42例结肠癌组织及癌旁组织中flTF mRNA的表达，结果显示结肠癌组织flTF mRNA相对表达量5.53（4.80～13.32）明显高于癌旁正常组织0.36（0.02～1.21），差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2  结肠癌组织及癌旁组织中asTF mRNA的表达

采用实时定量PCR检测42例结肠癌组织及癌旁组织中asTF mRNA的表达，结果显示结肠癌组织asTF mRNA相对表达量1.26（0.74～2.02）明显高于癌旁组织0.11（0.06～0.57），差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.3  结肠癌组织中TF的表达与结肠癌转移的关系

比较42例结肠癌组织中有远处转移标本组与无转移组中flTF及asTF的表达差异，结果显示有转移组flTF mRNA表达高于无转移组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3  讨论

组织因子作为机体凝血过程的启动子，也发挥许多非凝血功能，参与血管新生、炎症、动脉粥样斑块形成等多种生理病理过程。大量研究表明TF异常表达在多种肿瘤细胞表面，如胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌中，TF可与凝血因子Ⅶ形成复合物（TF-FⅦ）激活细胞表面蛋白酶激活受体，促进肿瘤相关血管生成和肿瘤增殖，并與肿瘤的侵袭、迁移、预后及药物抵抗等相关[3]。近年来新发现的组织因子异常剪接组织因子（alternatively spliced tissue factor，asTF），由于TF前体mRNA的整个第5号外显子被异常剪切导致第6号外显子编码的跨膜区和胞浆区缺失，形成由206个氨基酸组成的可溶性的asTF。与flTF信号传导和作用机制不同，asTF不参与凝血过程，却可以通过与整合素家族结合促进肿瘤相关血管生成[4]。现有研究针对flTF的功能和作用机制研究较多，对asTF的作用研究较少，asTF在肿瘤进展中所起的作用和具体机制仍不明确。

该研究通过RT-PCR方法检测结肠癌组织及癌旁正常组织flTF的表达，发现结肠癌组织中flTF mRNA[5.53（4.80～13.32）]较癌旁正常组织[0.36（0.02～1.21）]异常高表达，在有远处转移的结肠癌组织中flTF表达比癌旁正常组织中高4倍，差异有统计学意义（P<0.05）。Eriksson O通过免疫组织化学方法也证实结肠癌组织中高表达TF，Clouston HW体外培养结肠癌细胞株DLD-1发现其TF活性异常增强（10.5±5.23），该研究结果与其结果一致[5-6]。然而结肠癌组织中aTF表达水平还未有研究，该研究通过RT-PCR方法同时检测结肠癌组织及癌旁组织的asTF mRNA水平并分析与肿瘤远处转移的关系，发现asTF也异常高表达于结肠癌组织中，并在有远处转移的结肠癌组织中更高表达，提示flTF及asTF的高表达都与结肠癌转移密切相关，其是肿瘤进展的触发因素还是结果及两者之间的关联还有待进一步研究探讨。相继有研究者发现TF亚型的高表达与其他肿瘤进展也有一定的关系，Wu M等[7]研究发现flTF及asTF均高表达于胃癌组织中[7.45（0.34～33.68）、0.88（0.07～26.00）]，高表达flTF及asTF的胃癌患者生存期较短，推测flTF及asTF表达水平是关系胃癌患者预后的独立危险因素。Rollin等[8]在57例非小细胞肺癌患者中的临床研究中发现肿瘤中asTF的高表达可缩短患者的生存时间;Kocaturk等[9]指出asTF与乳腺癌肿瘤的大小、分期密切相关。提示flTF及asTF可能作为临床中监测肿瘤进展的危险因子。体内外研究表明运用TF亚型抗体能抑制胰管腺癌、乳腺癌、肺癌等的增殖和转移，提示TF可能成为恶性肿瘤新的治疗靶点。

[參考文献]

[1]  Versteeg HH.Tissue Factor： Old and New Links with Cancer Biology[J].Semin Thromb Hemost，2015，41（7）：747-755.

[2]  胡丽超，周红，武标，等.c-Jun/AP-1在因子Ⅶa促进SW620细胞增殖和迁移中的激活及其调控作用[J].江苏医药，2013，39（7）：764-766.

[3]  Graf C， Ruf W.Tissue factor asa mediator of coagulation and signaling in cancer and chronic inflammation[J].Thromb Res. 2018，164（1）：S143-S147.

[4]  Hisada Y， Mackman N.TissueFactor and Cancer： Regulation， Tumor Growth， and Metastasis[J].Semin Thromb Hemost，2019，45（4）：385-395.

[5]  Eriksson O，Asplund A，Hegde G，et al.A stromal cell popul ation in the large intestine identified by tissue factor expression that is lost during colorectal cancer progression[J].Thromb Haemost，2016，116（6）：1050-1059.

[6]  Clouston HW，Rees PA， Lamb R， et al.Effect of Tissue Factor on Colorectal Cancer Stem Cells[J].Anticancer Res，2018，38（5）：2635-2642.

[7]  Wu M， Chen L， Xu T，et al.Prognostic values of tissue factor and its alternatively splice transcripts in human gastric cancertissues[J].Oncotarget，2017，16（32）：53137-53145.

[8]  Rollin J， Regina S， Gruel Y.Tumor expression of alternatively spliced tissue factor is a prognostic marker in non-small cell lung cancer[J].J Thromb Haemost，2010，8（3）：607-610.

[9]  Kocatürk B， Tieken C， Vreeken D， et al.Alternatively spliced tissue factor synergizes with the estrogen receptor pathway in promoting breast cancer progression[J].J Thromb Haemost，2015，13（9）：1683-1693.

（收稿日期：2020-01-06）