响应面优化酶解—微波辅助提取桑叶多糖的工艺研究

朱亚伟 王立涛 安娟艳 吕慕洁 孙建航 郭 娜 付玉杰*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2.东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040；3.北京林业大学林学院，北京 100083；4.哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，哈尔滨 150000)

桑(MorusalbaL.)属于桑科(Moraceae)桑属(Morus)的乔木或灌木，原产我国中部和北部，现东北至西南各省区，西北直至新疆均有栽培[1]。桑叶不仅可以作为桑蚕的饲料，而且也是最常用的传统中药材，具有清热解表、疏散风热、清肝明目之功效[2]。桑叶中的活性物质主要有桑叶多糖、多酚、黄酮、生物碱、氨基酸以及维生素等[3]，具有防治糖尿病、降低血压、抗氧化、抗炎[4]等药理作用。其中桑叶多糖(Mulberry leaves polysaccharides，MLPs)是桑叶的主要活性成分，具有多种生物活性，如降糖、抗炎、抗氧化和增强免疫力等[5]。随着人们健康意识的提高，对绿色食品的需求与日俱增，桑叶多糖受到了越来越多研究者的关注。程等[6]研究指出，桑叶多糖主要由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖等单糖组成。Wu[7]通过α-淀粉酶辅助法提取了桑叶多糖MLP-1，通过动物实验指出MLP-1具有抑制肾纤维化的能力以及治疗糖尿病性肾病的潜力；Zhang等[8]研究指出，MLPsⅡ可抑制糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡和改善胰岛β细胞分泌胰岛素的能力；Yuan等[9]研究指出，通过热水提取法得到的粗MLPs及其纯化馏分，通过体外研究，发现粗MLPs及其纯化馏分均表现出了较好的抗氧化活性，特别是具有清除超氧化物，ABTS自由基以及和Fe2+螯合的能力。目前对于桑叶多糖的提取方法主要有：超声提取法、酶——超声辅助提取法、微波辅助提取法、超高压提取法、热水——酶辅助提取法等[10]。其中酶解法具有耗能少，时间短以及提取的多糖品质高等特点，并且提取工艺简便，处理条件温和。微波辅助提取法相比其他传统提取方法，具有升温快速均匀、热效率高、无污染、溶剂回收率高等优点，可大大缩短提取时间，提高萃取率，节约成本。此外，当前以酶——微波辅助提取法进行桑叶多糖的提取未见报道。

因此本研究以桑叶多糖提取率为考察指标，采用酶解——微波辅助提取法，在单因素条件优化的基础上，结合具有试验次数少、周期短、精度高的Box-Behnken(BBD)-Response Surface Methodolog(RSM)响应面法进行桑叶多糖提取工艺的优化，以期获得桑叶多糖提取率较高的方法，为工业化提取桑叶多糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑叶，2018年采自于黑龙江省哈尔滨市东北林业大学林场(127°37′26″E，45°43′20″N)，置鼓风干燥烘箱，45℃烘干至恒重，并粉碎至60目以下；纤维素酶，无水葡萄糖购自阿拉丁(上海)试剂有限公司；苯酚、浓硫酸、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

YP2002型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；BT25S型电子天平，德国Sartorius公司；WFH-203型紫外分析仪，上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

本研究采用苯酚—硫酸法测定桑叶中的桑叶多糖含量[11]，精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100.00 mg于100 mL容量瓶，用蒸馏水定容，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100 mL，即得100 μg·mL-1的葡萄糖标准溶液；精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于7只试管中，分别补加蒸馏水至2 mL，然后再分别加入浓度为5%的苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀后置40℃水浴中加热15 min，取出后迅速冷却至室温，同时用蒸馏水的反应液做空白，通过分光光度计在波长490 nm处测定吸光值，以吸光度A为纵坐标(y)，桑叶多糖浓度为横坐标(x)作标准曲线。

1.3.2 样品溶液的制备

取适量桑叶样品，加酶作用后，微波提取，减压过滤得到滤液，备用。

1.3.3 多糖含量与提取率的测定

精密吸取样品溶液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，蒸馏水定容。然后精密量取0.125 mL稀释后样品溶液和0.875 mL蒸馏水(稀释80倍)于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补至2 mL，然后再加入1.0 mL浓度为5%的苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀后置水浴中，40℃加热15 min，取出后迅速冷却至室温，同时用2.0 mL蒸馏水做空白，使用分光光度计在波长490 nm处测定吸光度。根据桑叶多糖的回归曲线方程求得其浓度。桑叶多糖提取率的计算公式：

桑叶多糖含量/%=(桑叶多糖质量/桑叶粉末质量)×100%

(1)

1.4 桑叶多糖提取的单因素试验

分别以超声辅助提取法(Ultrasonic assisted extraction,UAE)、酶解——超声辅助提取法(Enzymolysis-ultrasonic assisted extraction,EUAE)、微波辅助提取法(Microwave assisted extraction,MAE)、酶解——微波辅助提取法(Enzymolysis-microwave assisted extraction,EMAE)，以及酶浓度(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解温度(20、30、40、50和60℃)、pH(3、4、5、6、7)、酶解时间(20、30、40、50和60 min)进行单因素优化试验，考察这5个因素对桑叶多糖提取率的影响，每组单因素试验重复3遍。

1.5 BBD-RSM优化桑叶多糖的提取

根据Box-Behnken试验设计原理，在预实验结果基础上，选取液固比、提取时间和提取温度3实验因素进行3因素和3个水平实验，并对桑叶多糖提取工艺进行响应面分析，实验因素及水平见表1。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 桑叶多糖标准曲线的制备

在相同条件下通过分光光度计测定不同浓度桑叶多糖的吸光度，以桑叶多糖浓度为横坐标，以对应浓度下桑叶多糖的吸光度为纵坐标，得到桑叶多糖的标准曲线如图1。

拟合出的回归方程为y=0.006 5x+0.024 7，相关系数R2=0.992 8，说明在20～120 μg·mL-1范围中桑叶多糖与其吸光度之间线性关系良好，该标准曲线可用于后续实验分析。

图1 桑叶多糖的标准曲线Fig.1 Standard curve of MLPs

2.2 桑叶多糖提取的单因素试验结果

2.2.1 提取方法的筛选

提取方法是影响桑叶多糖提取率的重要因素，不同的提取方法机理各不相同，提取效果各异，因此本研究考察了不同提取方法对桑叶多糖提取率的影响。如图2所示，超声辅助提取法提取桑叶多糖时，其提取率为10.06%，采用酶解——超声辅助提取法时提取率升高至10.75%，采用酶解——微波辅助提取法桑叶多糖的提取效果最好，提取率为12.72%。因此本研究采用酶解——超声辅助提取法进行桑叶多糖的提取。

图2 不同提取方法对桑叶多糖提取率的影响Fig.2 Effect of different extraction methods on extraction yield of MLPs

图3 酶浓度、酶解温度、pH、酶解时间对桑叶多糖提取率的影响Fig.3 Effects of enzyme concentration, enzymolysis temperature, pH, and enzymolysis time on extraction yield of MLPs

2.2.2 酶浓度、酶解温度、pH、酶解时间对桑叶多糖提取率的影响

合适的酶浓度既可以最大限度的提高桑叶多糖的提取率，还可以节约酶试剂，减少资源的浪费。如图3A所示，酶浓度从1%升高至2%时，桑叶多糖的提取率得到了增加，但随着酶浓度的逐步增加，桑叶多糖的提取率呈现先降低后稳定的趋势，主要因为当酶浓度为2%时是酶活的最适浓度，酶浓度小于2%时，酶浓度偏低，酶解速率受限，当酶浓度大于2%，酶浓度的增加抑制了酶活性，造成桑叶多糖的提取率降低，因此桑叶多糖提取的最佳酶浓度为2%。

由于在酶解反应中，酶解温度显著影响酶活性，进而影响桑叶多糖的提取率，因此本研究考察了酶解温度对桑叶多糖提取率的影响。由图3B所示，随着温度的升高，桑叶多糖的提取率呈现先降低后急剧增高的趋势，当酶解温度为50℃时，桑叶多糖的提取率最高，较20℃升高了36.45%，但当温度升高至60℃时桑叶多糖的提取率降至最低。这是因为在20～50℃时，随着温度的升高，纤维素酶的活性和分子运动速率都得到增强，从而加速了细胞内物质的转移，但过高的温度可能会降低酶的活性，造成桑叶多糖提取率的降低。因此，桑叶多糖提取时的酶解温度为50℃。

在桑叶多糖提取过程中，pH也是通过影响酶活性进而影响桑叶多糖的提取率。由图3C所示，随着pH值的升高，桑叶多糖的提取率基本呈现先增高后降低的趋势，当pH为6时，酶活性最高，酶促反应效率最好，桑叶多糖提取率最高，当高于或低于此pH时，酶活降低，酶解速率减弱，桑叶多糖提取率降低。因此，提取桑叶多糖时的pH选择为6。

如图3D所示，当酶解时间从20 min增加至60 min过程中，桑叶多糖的提取率基本呈现先降低后稳定的趋势，当酶解时间为20 min时桑叶多糖的提取率最高，随着酶解时间的延长，酶解反应变得复杂，可能是因为生成其他非糖物质的含量增加，从而造成桑叶多糖提取率降低。因此，桑叶多糖提取的最适酶解时间为20 min。

2.3 桑叶多糖的BBD-RSM分析

2.3.1 桑叶多糖提取工艺的BBD分析

在单因素实验基础上，根据Box-Behnken实验设计原理，选择液固比、提取时间和提取温度进行三因素三水平的响应曲面分析法，对桑叶多糖的提取工艺进行优化，以确定桑叶多糖的最佳提取条件，实验结果见表2。实验结果采Design-Expert软件进行多元回归拟合，得到桑叶多糖提取得率(%)对液固比X1(mL·g-1)、提取时间X2(min)和提取温度X3(℃)的二次多项回归方程:Y=-192.85+3.73X1+2.39X2+4.27X3+8.61×10-3X1X2+0.01X1X3-1.08×10-3X2X3-0.15X12-0.10X22-0.03X32。

2.3.2 桑叶多糖提取工艺的方差分析

为了检验方程的有效性，对桑叶多糖提取的数学模型进行方差分析结果见表3。从表3可以看出，模型P<0.000 1，说明该回归模型达到了极显著水平，而失拟项P>0.05不显著，同时模型的相关系数R2=0.992 2，表明该回归模型拟合程度良好。此外，模型的修正相关系数AdjR2=0.982 2，说明该拟合方程很好的反映了液固比、提取时间以及提取温度与桑叶多糖提取率的关系。从该回归模型的方差分析还可以看出，液固比和提取时间对桑叶多糖提取率的影响极显著，二次项中X12,X22,X32的影响均达到极显著水平。因此，该模型可以用于对桑叶多糖的提取进行分析与预测。

图4 酶水解微波辅助提取桑的反应面 A.提取时间和液固比；B.提取温度和液固比；C.提取温度和提取时间Fig.4 The response surfaces of enzymolysis-microwave assisted extraction of MLPs A.Varying extraction time and liquid/solid ratio; B.Varying temperature and liquid/solid ratio; C.Varying temperature and extraction time

表2 从桑叶中提取桑叶多糖的Box-Behnken设计与结果

Table 2 Results of the Box-Behnken design for the extraction of MLPs from mulberryM.albaL. leaves

序号No.因素FactorsX1(La,mL·g-1)X2(tb,min)X3(Tc,℃)桑叶多糖提取率YieldofMLP(%)1-1(10)-1(5)0(75)4.2121(20)-1(5)0(75)7.963-1(10)1(15)0(75)8.1141(20)1(15)0(75)12.735-1(10)0(10)-1(65)5.5561(20)0(10)-1(65)9.677-1(10)0(10)1(85)4.4281(20)0(10)1(85)11.4790(15)-1(5)-1(65)5.95100(15)1(15)-1(65)10.82110(15)-1(5)1(85)7.26120(15)1(15)1(85)11.91130(15)0(10)0(75)13.98140(15)0(10)0(75)14.63150(15)0(10)0(75)14.28160(15)0(10)0(75)14.61170(15)0(10)0(75)14.63

注：a.液固比(mL·g-1)；b.提取时间(min)；c.提取温度 下同。

Note:a.Liquid/solid ratio(mL·g-1);b.Extraction time(min);c.Extraction temperature(℃) The same as below.

表3 从桑叶中提取桑叶多糖的二次模型的方差分析统计

Table 3 ANOVA statistics of the quadratic model for the extraction yield of MLPs from mulberryM.albaL. leaves

变量Variables平方和Sumofsquares自由度df均方和MeansquareF值F-valueP值P-value模型Model226.44925.1698.99<0.0001SignificantXa147.74147.71187.70<0.0001Xb241.39141.39162.85<0.0001Xc31.1911.194.670.0675X1X20.1910.190.730.4216X1X32.1612.168.490.0225X2X30.01210.0120.0460.8363X1257.41157.41225.87<0.0001X2225.95125.95102.10<0.0001X3236.83136.83144.90<0.0001失拟项Lackoffit1.440.0635NotsignificantR20.9922AdjR20.9822

2.2.3 响应面分析

通过响应面优化实验得到各因素之间交互作用的三维立体图，液固比、提取时间、提取温度的交互作用如图4所示。由图4A可以看出，随着提取时间的延长，桑叶多糖得率逐渐增高，提取时间达到12 min后，桑叶多糖的提取率趋于平衡，随着液固比的增大，桑叶多糖的提取率先增大后减小。由提取温度与液固比对桑叶多糖提取率的交互影响的响应面(图4B)可以看出，温度升高，桑叶多糖提取率增加，同时由于温度升高，桑叶多糖的降解也加剧，因此，温度过高不利于桑叶多糖的提取，随着液固比的增加，桑叶多糖的提取率也呈现出先增加后降低的趋势。由提取温度与提取时间对桑叶多糖提取率的交互影响的响应面(图4C)可以看出，提取时间增加，有助于提取的进行，但提取时间过长，也会引起桑叶多糖的部分降解，温度太低不利于反应的进行，太高反而会造成桑叶多糖水解。综上所述，液固比、提取时间、提取温度之间存在明显的交互作用。

2.4 优化提取参数与实验验证

在建立的数学模型的基础上，获得最佳实验条件如下：液固比15.59 mL·g-1，提取时间13.29 min，提取温度75.92℃，相应的桑叶多糖提取率为15.12%。考虑到桑叶多糖提取时的实际操作，将液固比，提取时间和提取温度分别修改为15 mL·g-1，13 min和76℃，此时MLPs的实际提取率为15.23%，与预测值之间的相对误差仅为0.72%，建立的模型真实可靠。

3 结论

本研究以桑叶多糖提取率为考察指标，在考察不同的提取方法、酶浓度、酶解温度、pH、酶解时间5个单因素的基础上，结合BBD-RSM方法优化了液固比、提取时间、提取温度。该模型拟合程度较高，能够适用于桑叶多糖提取条件的优化，最终获得了桑叶多糖的最佳提取条件：采用酶解—微波辅助提取法，在酶含量2%、酶解温度50℃、pH6、酶解时间20 min、液固比15 mL·g-1、提取时间13 min、提取温度76℃，在此条件下桑叶多糖的实际提取率为15.23%，与预测值之间的相对误差仅为0.72%，模型真实可靠。本研究为桑叶多糖的开发利用提供了重要的研究基础，具有一定的潜在应用价值。