生姜黄酮类物质的酶法辅助提取及抑菌活性分析

郭春晓，文子萱，刘子涵，徐元晶

（曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜273165）

生姜（Rhizoma Zingiberis Recens），属单子叶植物纲，大多具有块状根，通常具有芳香气味，原产于太平洋群岛，现多栽植于我国中部、东南部及西南部各省市. 作为食药两用植物，生姜具有较高的营养价值，其可食用部分高达95%，生姜日常可作为蔬菜食用，又可作调味品被人们广泛使用[1].

生姜具有较高的药用价值，含有多种功能因子，如具有辣味效应的姜辣素、姜酚和姜酮等，具有挥发性的油物质类等. 现代医学研究证明，生姜具有缓解肠胃、解毒、促进新陈代谢、增强心脏功能、降低血糖、保护胆脏和肝脏、杀菌，增强免疫力，减少机体炎症、抗氧化作用和抗过敏、促使肿瘤细胞死亡等方面的重要功效[2]. 其中生姜中黄酮类化合物是一种重要的活性物质，具有抗菌、抗炎、保护心血管、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等功能. 目前，黄酮类物质的提取方法及其活性研究已成为研究热点之一[2-5].

近年的许多研究都涉及提取方法的优化，如：超声辅助提取、微波辅助提取、酶解提取等. 于洁等对生姜黄酮的提取及性能进行了研究[6]，刘玉梅等研究了复合酶协同超声波法提取香椿老叶总黄酮的工艺条件[8]. 植物细胞壁中含有的果胶类、纤维素等成分使用纤维素酶可将其分解，促进功效成分的溶出，提高提取率，且与乙醇联用还具有协同作用. 故本文拟对酶法辅助提取生姜黄酮类物质的工艺条件进行研究，以所得的生姜黄酮类提取液为试验材料，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌、黑曲霉为供试菌种，对生姜黄酮物质的抑菌活性进行试验分析；以对枯草芽孢杆菌的抑菌效果为指标，研究不同条件下生姜黄酮类物质的抑菌效果，以期为生姜黄酮类物质的开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生姜：市场购买. 要求本色淡黄，饱满而有光泽，根茎较完整，姜肉质感较硬，没有烂心和烂顶的特征、不蔫萎、也没有明显的虫伤，表皮泥土较少、比较洁净，没有长或短的根须，没有受热、受冻的腐烂现象.

牛肉膏蛋白胨培养基、纤维素酶、大肠杆菌（Escherichiacoli）、青霉菌（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubitlis）、无水乙醇（AR）、亚硝酸钠（AR）、硝酸铝（AR）等.

1.2 仪器与设备

AlphaClean 1300 超净工作台、紫外分光光度计、LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅、KQ3200 超声波清洗器、移液枪、IGS180恒温培养箱等.

1.3 试验方法

1.3.1 生姜黄酮类物质的提取

用清水洗净生姜上的泥土沙尘，然后进行晾干处理. 将晾干后的生姜样品切碎成小块，将小块放入烘箱中，温度调节为60 ℃左右，进行为期一天的干燥操作. 取出后，将已干燥完全的小块研磨成细细的粉状物质，密封后置于适宜条件下保存，备用.

准确称取一定量的生姜粉末，于50 mL 圆底离心管中，加入适量纤维素酶溶液，选择合适条件提取一段时间后，95 ℃灭活酶10 min，再加入适量无水乙醇配制成80%浓度的乙醇溶液，在一定时间和温度下进行超声提取[7].

1.3.2 总黄酮得率计算

分别准确量取浓度为0.2 mg/mL 的芦丁对照品溶液（1.00、2.00、3.00、4.00、5.00）mL 于25 mL 容量瓶中，分别加入2 mL 0.5 mol/L AlCl3溶液，显色，采用pH值5.8的乙酸/乙酸钠缓冲溶液定容，超声振荡5 min，静置15 min，得5个浓度的芦丁测定液.

经光谱扫描得最大吸收波长为415 nm，于415 nm 波长处测定吸光度（A），对不同浓度（C）芦丁和相对应的吸光度（A）进行线性回归，得到芦丁标准曲线回归方程为y=31.72x-1.05 (R2=0.9963)，在（8 ～40）μg/mL范围内线性关系良好[8].总黄酮得率按下式计算：

1.3.3 生姜黄酮类物质的抑菌试验

取供试菌种，细菌用牛肉膏蛋白陈培养基37 ℃下培养24 h，霉菌用PDA 培养基29 ℃下培养48 h.利用接种环挑取活化过的菌种一环，用10 mL 无菌水制成菌悬液，备用.

采用滤纸片扩散法[9-10]测定黄酮类物质抑菌活性. 将经过灭菌操作的滤纸片（直径为6 mm），放入黄酮提取液，处理时间约为12 h，然后晾干，备用.吸取0.2 ml 菌悬液均匀涂抹到平板上，生姜提取液的滤纸圆片（6 mm)放到涂有菌液的平板上，每平板上贴4片滤纸片，另外贴1片已灭菌的纸片作空白对照，每个实验平行两次，记录其抑菌强度[11].

以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、青霉菌、黑曲霉为供试菌种，选择1.0%、1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、8.0%、10.0%的生姜黄酮类物质提取液. 考察不同浓度的提取液对上述菌种的抑菌效果，研究其最小抑菌浓度[12].

1.3.4 不同pH值对生姜黄酮化合物抑菌作用的影响

取6 份相同提取液，利用0.1 ml/mL 的HCl 溶液、0.1 mol/mL 的NaOH 溶液，调节pH 值为2、4、6、8、10、12，室温下静置12 h[13]. 采用滤纸片扩散法，重复多次测定抑菌圈直径，计算其平均值，考察pH 值对生姜黄酮化合物抑菌作用的影响.

1.3.5 不同温度对生姜黄酮化合物抑菌作用的影响

取6 份等量的黄酮提取液，然后分别放置于（20、40、60、80、100、120）℃下，其他条件相同，处理时间都为20 min[14].采用滤纸片扩散法，重复多次测定抑菌圈直径，计算其平均值，考察不同温度处理对生姜黄酮化合物抑菌作用的影响.

1.3.5 光照时间对生姜黄酮化合物抑菌作用的影响

取6 份等量的黄酮提取液，然后置于相同的白炽灯下，进行照射，放置时间以10 min 为起始点，每10 min为一梯度，至60 min.采用滤纸片扩散法[9-10]，重复多次测定抑菌圈直径，计算其平均值，考察光照时间对生姜黄酮化合物抑菌作用的影响.

2 结果与分析

2.1 正交实验优化酶法辅助提取生姜黄酮类物质工艺条件

根据文献资料，选择纤维素酶水解生姜提取黄酮类物质，以酶用量、酶解温度、酶解时间、pH 为因素，采用L9(34)四因素三水平正交实验优化酶法提取生姜黄酮类物质的工艺条件，正交实验表如表1 所示，以黄酮类物质的得率为指标，结果见表2.

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验优化酶法辅助提取生姜黄酮类物质

基于表2，根据极差分析，4 个因素对黄酮提取率的影响大小顺序为：C＞D＞A＞B，即pH＞酶解温度＞酶解时间＞酶用量，适宜的提取条件是酶解时间80 min，酶用量1.4%、pH值6，酶解温度45 ℃.

2.1 生姜黄酮类物质的抑菌活性试验结.

生姜黄酮类物质对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌、黑曲霉的抑菌活性试验，结果如表3 所示. 生姜黄酮对各菌种都有一定的抑菌效果. 按照对菌种的抑菌强度进行排序，顺序依次为枯草芽孢杆菌＞黑曲霉＞金黄色葡萄球菌＞青霉菌＞大肠杆菌. 实验测得，对上述菌种的最小抑菌浓度按照大小排序，分别为大肠杆菌（10%）＞青霉菌（6%）＞金黄色葡萄球菌（4.5%）＞黑曲霉（3%）＞枯草芽孢杆菌（1.5%）.

表3 生姜黄酮的抑菌活性试验结果

注：“-”表示无抑菌圈，“+”表示有抑菌圈

2.2 不同pH对生姜黄酮类物质抑菌作用的影响

pH 对生姜黄酮类物质抑菌效果的研究结果如表4 所示. 在pH 值为2-6 时，抑菌圈观测为最大，抑菌较稳定；在pH 值为6-10的范围内，抑菌圈直径有所变化，呈缩小趋势，但变动幅度较小；当pH值大于10 时，抑菌圈的直径大小明显缩小. 因此，微生物在较酸性的条件下不宜生长，此时的抑菌效果也较好，且pH值为4时抑菌强度最大.

表4 不同PH值对生姜黄酮抑菌作用的影响

2.3 不同温度对生姜黄酮类物质抑菌作用的影响

温度因素对生姜黄酮类物质抑菌效果的研究结果如表5所示.随温度的不断增高，抑菌圈直径的大小先增大后缩小，达到（80 ～100）℃时为最高，当温度更高后，其值略有下降. 因此温度为80 ℃左右时抑菌作用性最好.原因可能为：随温度升高，水分逐渐蒸发，导致黄酮提取物的溶解度增加，抑菌作用也随之增加，但当温度更高时，化合物的结构在高温下被破坏，所以抑菌作用逐渐变差[15]. 值得一提的是，高温时抑菌作用变化并没有很明显，说明黄酮提取物在高温下也可以发挥作用.

表5 不同温度对生姜黄酮抑菌作用的影响

2.4 光照时间对生姜黄酮类物质抑菌作用的影响

光照时间对生姜黄酮类物质抑菌效果的研究结果如表6所示.随着光照时间的增加，抑菌圈直径不断缩小. 因此，为获得更好的储藏效果和抑菌效果，可将生姜置于避光条件下储存.

表6 不同光照时间对生姜黄酮抑菌作用的影响

3 结论

本文采用酶法辅助提取生姜黄酮类物质，采用正交实验优化了其提取条件，适宜的提取条件是酶解时间80 min，酶的用量1.4%、pH 值6，酶解温度45 ℃，同时研究了生姜黄酮类物质对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌、黑曲霉的抑菌活性，生姜黄酮类物质对各菌种都有一定的抑菌效果. 按照对菌种的抑菌强度进行排序，顺序依次为枯草芽孢杆菌＞黑曲霉＞青霉菌＞大肠杆菌. 实验测得，对上述菌种的最小抑菌浓度按照大小排序，分别为大肠杆菌（10%）＞青霉菌（5%）＞黑曲霉（3%）＞枯草芽孢杆菌（1.5%）. 选择pH 值为2-6，温度为80 ℃，避光条件下可以黄酮类物质可以获得较好的抑菌效果.

生姜作为一类同时具有食药功能的物质，其发展和研究价值仍在探索之中. 作为生姜中的抑菌性物质，黄酮具有较强的抑菌作用，可用作良好的抑菌剂，生姜中其他具有抑菌作用的成分也值得去进一步研究和开发利用，以期得到最佳的利用效果，提供生姜这一植物的利用加工，提高其附加值.