miR-191-5p通过SATB1调控滋养层细胞上皮-间质转化参与子痫前期发病的机制

周俏苗 陈秋霞 黄海燕 许晶 肖美芳 龚护民 吴栋才

1海南省妇女儿童医学中心妇产科（海口570000）；2海南省人民医院妇产科（海口570000）

子痫前期（pre-eclampsia，PE）为妊娠期高血压的一 种［1］。研究证实微小RNA（microRNA，miRNA）、炎症反应、氧化应激、血管生成失衡以及信号通路等均在PE 的发病中发挥重要作用［2-3］。滋养层细胞的功能失调被认为是PE 发病的重要病理机制之一［4］。近年来AT富集序列特异性结合蛋白1（special AT-rich sequence-binding protein 1，SATB1）与PE 滋养层细胞的关联越来越受到关注。SATB1 基因敲除显著降低了β-catenin 水平，降低了滋养层细胞的迁移和侵袭能力［5］。此外，缺氧可抑制子痫前期发病过程中SATB1 和β-catenin 的表达，从而影响细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭［6］。CHOI 等［7］在对子痫前期的miRNA 表达谱进行分析的时候发现，相对于正常胎盘组织，miR-191 在重度子痫前期胎盘组织中表达增强。但是对于miR-191 具体如何参与PE 的进展尚没有相关研究。本研究发现miR-191-5p 与SATB1 存在靶向结合位点，通过观察滋养层细胞的变化探究miR-191-5p 靶向SATB1 参与PE 调控的潜在机制。

1 资料与方法

1.1 细胞培养及分组转染人胎盘滋养层细胞系HTR-8/SVneo 购买于美国ATCC 细胞库，人绒毛膜癌细胞系JEG-3、JAR 购买于中科院上海细胞库。取对数生长期的HTR-8/SVneo 细胞以5×105/mL的浓度接种于6 孔板中培养，分组进行转染。包括mimics NC 组（miRNA mimic 阴性对照）、mimics miR-191-5p 组（miRNA-191-5p 模拟物转染）、inhibitors NC 组（miRNA 抑制剂阴性对照）、inhibitors miR-191-5p 组（miR-191-5p 抑制剂），以及pcDNA组（空载质粒）、pcDNA+SATB1 组（SATB1 过表达质粒）、si-NC 组（干扰SATB1 表达阴性对照）、si-SATB1 组（干扰SATB1 表达）。使用lipofectamin 2000（Invitrogen）试剂盒进行转染，转染步骤依据试剂盒说明书进行。

1.2 双荧光素酶报告实验生信网站Target Scan预测miR-191-5p 与SATB1 存在结合位点，再用双荧光素酶报告实验验证miR-191-5p 与SATB1 的靶向调节调节作用。实验步骤依据双荧光素酶试剂盒（Promega）说明书进行。

1.3 qRT-PCR 检测相关基因按照说明书指示，使用TRIzol 试剂（Life 公司）进行总RNA 的提取，Nano-Drop 2000c（Thermo Scientific）对提取的RNA进行定量。接着按照反转录试剂盒说明书指示（TaKaRa，Japan），将1 μg 总RNA 反转录成cDNA。采用实时荧光定量PCR 试剂盒（Qiagen，美国）检测目的基因的表达。以GAPDH 作为其他基因内参照，以U6 为miRNA-191-5p 的内参照，2-ΔΔCt法计算mRNA 表达，所有引物均来自上海生工公司。

1.4 WB 检测目的蛋白表达转染后细胞用RIPA裂解液进行裂解提取总蛋白，BCA 试剂盒（Thermo Fisher，美国）检测蛋白浓度。行SDS-凝胶电泳后，湿转法将蛋白转移至PVDF 膜上（Millipore，美国）。5% BSA 封闭后加入一抗，4 ℃孵育过夜。PBST 洗涤3 次，每次15 min。然后加入稀释好的羊抗兔二抗室温孵育90 min，PBST 洗涤3次，每次15 min。ECL 显影。暗室曝光，Image J软件分析蛋白表达。抗体均购自Proteintech公司。

1.5 MTT 检测细胞增殖各组细胞转染48 h 后，取对数生长期细胞接种于96 孔板，每组6 个复孔。分别培养24、48、72 h 后，弃掉培养，加入100 μL 新鲜培养基，接着加入10 μL（5 mg/mL）/孔的MTT 溶液（购买于上海碧云天生物），再将96 孔板放入37 ℃、5%CO2培养箱中孵育4 h，酶标仪测定570 nm 处吸光度。

1.6 EdU 检测细胞增殖各组细胞转染48 h 后，取对数生长期细胞（4×103细胞/孔）接种于96 孔板，按照EdU 检测试剂盒（锐博，广州）说明进行操作。

1.7 Transwell 检测迁移转染48 h 后，各组细胞用无血清培养基中饥饿处理24 h，PBS 冲洗2 次。将7 000 μL 含10% FBS 的RPMI1640 培养基加入下室；上室加入含1% FBS 的RPMI1640 培养基重悬好的细胞悬液约200 μL，37 ℃培养24 h 后，取出Transwell 小室，棉签擦去上室内面的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%结晶紫溶液染色15 min，PBS 洗3 遍，用倒置显微镜随机选取5 个视野进行拍照，穿膜细胞计数。

1.8 统计学方法所有数据均基于至少3 个独立实验并采用均值±标准差的形式表示，两组间比较为t检验，多组间的比较应采用单因素方差分析（SPSS 21.0，Inc，Chicago，IL，USA）。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-191-5p 及SATB1 在人胎盘滋养层细胞系HTR-8/SVneo 及人绒毛膜癌细胞系JEG-3、JAR 中的表达同JEG-3、JAR 相比，miR-191-5p在HTR-8/Svneo 细胞系中表达上调，SATB1 表达下调（均P＜0.05）。故人胎盘滋养层细胞系HTR-8/Svneo 被用于后续实验（图1）。

2.2 miR-191-5p 靶向负调控SATB1生信网站分析发现miR-191-5p 与SATB1 存在结合位点（图2A）。接着双荧光素酶报告实验发现，与mimics NC 组相比，mimics miR-191-5p 与野生型SATB1-WT 共转染组中荧光素酶活性强度下降（P＜0.05，t=1.563，图2B）。同mimics NC 相比，mimics miR-191-5p 组SATB1 低表达（P＜0.05，t=2.67）。以上结果说明miR-191-5p 可以靶向调控SATB1 基因表达下调。见图2。

图1 miR-191-5p 及SATB1 在滋养层来源的细胞系的表达Fig.1 Expression of miR-191-5p and SATB1 in trophoblast derived cell lines

图2 miR-191-5p 与SATB1 的靶向关系验证Fig.2 Target relationship verification between miR-191-5p and SATB1

2.3 过表达/抑制miR-191-5p 表达可抑制/促进HTR-8/SVneo 细胞增殖及迁移同mimics NC 组相比，mimics miR-191-5p 组增殖能力下降28%（P＜0.05，t=2.18），同时，迁移能力降低（P＜0.05，t=1.42）；mimics miR-191-5p 组在基因和蛋白水平MMP-2（P＜0.05，t=1.82；P＜0.05，t=1.81）及MMP-9（P＜0.05，t=1.11；P＜0.05，t=5.72）均表达下调。见图3。

图3 过表达/抑制miR-191-5p 后HTR-8/SVneo 细胞增殖及迁移结果Fig.3 Cell proliferation and migration results of HTR-8/Svneo after overexpression or inhibition of miR-191-5p

2.4 过表达/抑制miR-191-5p 表达可抑制/促进HTR-8/SVneo 细胞系上皮间质转化同mimics NC 相比，mimics miR-191-5p 组Vimentin（P＜0.05，t=2.58）、N-cadherin（P＜0.05，t=2.61）在蛋白水平均表达下调，E-cadherin（P＜0.05，t=11.58）表达上调。见图4。

2.5 过表达/干扰SATB1 后会抑制/促进HTR-8/SVneo 细胞系增殖及迁移同pcDNA 相比，pcDNA+SATB1 组细胞EdU 阳性细胞增加24%（P＜0.05，t=1.37），同时迁移能力增加（P＜0.05，t=3.08）；pcDNA+SATB1组MMP-2（P＜0.05，t=91.42；P＜0.05，t=1.91）、MMP-9（P＜0.05，t=2.03；P＜0.05，t=5.08）在基因和蛋白水平均表达上调。见图5。

2.6 过表达/干扰SATB1 后会抑制/促进HTR-8/SVneo 细胞系上皮间质转化同pcDNA 相比，pcDNA+SATB1 组Vimentin（P＜0.05，t=4.61）、N-cadherin（P＜0.05，t=1.42）在蛋白水平均表达上调，E-cadherin（P＜0.05，t=3.08）表达下调。见图6。

3 讨论

图4 过表达/抑制miR-191-5p 后上皮间质转化相关蛋白的表达Fig.4 Expression of Epithelial stromal transformation related proteins after overexpression or inhibition of miR-191-5p

图5 过表达/干扰SATB1 后HTR-8/SVneo 细胞增殖及迁移结果Fig.5 Cell proliferation and migration results of HTR-8/Svneo after overexpression or silencing of SATB1

有研究在探讨子宫内膜异位症这一妇科疾病时发现，miR-191 在子宫内膜异位症中的表达高于正常人，且miR-191 能够通过对TIMP3 进行调节从而影响细胞的增殖和侵袭［8］。另外也有研究［7］发现，miR-191 的表达在PE 胎盘中增强，推测miR-191 的异常表达与PE 的进展有关。本研究通过探讨miR-191-5p 调控滋养层细胞进而参与PE 进展的角度对miR-191-5p 的作用进行了探究，结果发现过表达miR-191-5p 能够抑制HTR-8/Svneo 细胞的增殖和迁移。MMP-2 和MMP-9 是基质金属蛋白酶家族的重要成员，其能够降解细胞外基质，在组织重构、细胞的侵袭转移、血管生成等多方面发挥重要作用［9］。此外，WANG 等［10］证实，EG-VEGF 能够激活ERK 信号通路，上调MMP-2 和MMP-9 的表达进而增进滋养层HTR-8/Svneo 细胞侵袭。通过上调HTR-8/Svneo 细胞中的miR-191-5p 结果表明，HTR-8/Svneo 细胞的增殖活力、侵袭被抑制，MMP-2 和MMP-9 的表达也降低。进一步表明了miR-191-5p 在影响MMP 家族因子表达以及滋养层细胞中的作用，提示以miR-191-5p 作为靶点对PE 进行干预的可能。

图6 过表达/干扰SATB1 后上皮间质转化相关蛋白的表达Fig.6 Expression of Epithelial stromal transformation related proteins after overexpression or silencing of SATB1

有文献［11］表明，SATB1 在人体胎盘中的表达受氧化应激的影响，其可能通过调控β-catenin 信号通路的影响进而影响滋养层细胞的侵袭和迁移。此外WU 等［6］在研究中证实了SATB1 在PE 进展中发挥重要作用。本研究发现，miR-191-5p 与SATB1 之间存在靶向结合位点，推测其可能通过相互作用进而影响PE。之后通过干扰HTR-8/Svneo 细胞中SATB1 的表达进而发现SATB1 能够对HTR-8/Svneo 细胞的增殖、侵袭进行调控。EMT 指的是上皮细胞向间质细胞转化的过程，该过程使得转化后的细胞丧失黏附功能并且增强侵袭和迁移能力［12］。滋养细胞分化不良以及螺旋动脉重塑异常被认为是引起PE 的重要原因［13］。而近年来越来越多的研究表明滋养层细胞EMT 减弱进而使得滋养细胞侵袭降低可能是引发PE 的重要原因。EMT 发生时，E-cadherin 表达降低而N-cadherin 和Vimentin 表达增加。本研究干扰HTR-8/Svneo 细胞中miR-191-5p 和SATB1 表达后对EMT相关因子进行检测发现，过表达miR-191-5p 或抑制SATB1 的表达能够抑制HTR-8/Svneo 细胞EMT的发生。

综上所述，miR-191-5p 有望成为PE 治疗的重要靶点，本研究也将为PE 相关靶向药物的研发提供一些方向。