糖肾宁对KK-Ay小鼠足细胞上皮间质转分化的作用研究

崔方强 高彦彬 王悦芬 孟元 蔡朕 刘志强 江心灿 赵文景

随着糖尿病发病率的逐年升高,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)已经成为导致终末期肾病的主要原因[1-2]。肾小球细胞外基质增生是DN典型的病理改变,能够引起蛋白尿的产生及疾病的进展[3]。但是DN肾小球细胞外基质增生的病理基质目前并不清楚,因此缺少相应的治疗措施。研究证实,足细胞上皮间质转分化在DN肾小球细胞外基质增生过程中起着重要作用[4]。足细胞上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)不仅可以引起蛋白尿,也可以导致肾小球Collagen I及FN蛋白累积,介导肾小球细胞外基质增生及肾小球硬化[5]。因此抑制足细胞EMT是DN防治研究的热点。糖肾宁广泛应用于临床防治DN,并且临床试验已经证实其具有确切的临床疗效[6],本实验旨在探讨糖肾宁对于KK-Ay小鼠肾小球细胞外基质增生及足细胞EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄雄性KK-Ay小鼠及8周龄雄性C57BL/6J小鼠全部购自全部购自北京华阜康生物科技股份有限公司,实验动物许可证号：SCXK(京)2014-0004。

1.2 实验试剂及药物

Collagen I抗体(ab34710,abcam,英国),FN抗体(ab2413,abcam,英国),P-cadherin抗体(ab6528,abcam,英国),FSP-1抗体(ab27957,abcam,英国),肌酐测定试剂盒(批号：657881,ROCHE,瑞士),尿素氮测定试剂盒(批号：658513,ROCHE,瑞士),糖肾宁浸膏粉(配比：黄芪4份、葛根2份、川芎2份、大黄1份、金樱子2份、倒扣草3份,由首都医科大学中医药学院制剂室制备),缬沙坦胶囊(北京诺华制药有限公司,批号：X1440)。

1.3 实验仪器

离心机(Sigma,3K18),倒置显微镜(德国Leica公司)；凝胶化学发光成像分析系统(FUSION FX6 XT,Vilber公司)；高电流电泳仪电源(美国伯乐公司)；酶标仪(北京市新风机电技术公司,ZS-3)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型建立及分组给药 KK-Ay小鼠给予高脂饲料喂养,C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养,喂养期间小鼠自由进食及饮水,4周后检测血糖及24小时尿蛋白定量。当KK-Ay小鼠随机血糖≥16.7 mmol/L,并且24小时尿蛋白较 C57BL/6J小鼠明显升高时,DN小鼠模型造模成功。将造模成功的KK-Ay小鼠随机分为模型组、糖肾宁组、缬沙坦组,每组10只。另取10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。各组小鼠给予灌胃给药干预：糖肾宁组小鼠给予糖肾宁灌胃剂,灌胃剂量按生药剂量计算为20 g/(kg·d)；缬沙坦组小鼠给予缬沙坦灌胃剂,灌胃剂量为10 mg/(kg·d)；正常对照组和模型组予等量蒸馏水灌胃。实验过程中,KK-Ay小鼠继予高脂饲料喂养,而C57BL/6J小鼠予普通饲料喂养。干预12周后,心尖取血,处死后摘取肾脏。

1.4.2 PAS染色 肾脏组织固定后进行石蜡切片,然后进行程序化脱蜡,用无色盐基性品红溶液对石蜡切片染色。流水冲洗后,苏木精染料染色5～10分钟。将石蜡切片脱水透明后,中性树脂封片。

1.4.3 免疫组化 肾脏组织固定后进行石蜡切片,然后程序化脱蜡,组织切片抗原修复后,用山羊血清进行封闭。将配制好的一抗溶液(Collagen I 1∶1000,FN 1∶1000)滴加到玻片上,4℃孵育过夜。冲洗后滴加二抗室温孵育1小时。苏木精染色后进行脱水透明,中性树脂封片。

1.4.4 Western Blot 每组选取4例小鼠进行检测。肾脏蛋白组织电泳后,将分离的蛋白质转移至PVDF膜上,滴加配制好的一抗溶液(P-cadherin 1∶500,FSP-1 1∶500),4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗室温孵育2小时,ECL试剂暗室内胶片曝光,扫描胶片,用图像分析软件分析目标条带。

1.4.5 实时荧光定量PRC 每组选取5例小鼠进行检测。采用Trizol提取小鼠肾脏总RNA,然后用反转录试剂盒将mRNA转录为cDNA,实时荧光定量PCR仪进行扩增及荧光定量,实验操作按照产品说明书进行,采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。利用Primer 5.0软件设计引物序列,见表1。

表1 引物序列

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0进行统计处理,统计数据均符合正态分布且方差齐,计量资料以均数±标准差(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用LSD检验,P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 糖肾宁对KK-Ay小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影响

与正常对照组相比,模型组小鼠血清肌酐、尿素氮水平明显升高(P＜0.05)；与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠血清肌酐及尿素氮水平明显降低(P＜0.05)。提示糖肾宁能够明显降低KKAy小鼠血清肌酐、尿素氮水平。见表2。

表2 各组小鼠血清肌酐及尿素氮水平比较(±s)

表2 各组小鼠血清肌酐及尿素氮水平比较(±s)

注：与正常对照组相比,aP＜0.05；与模型组相比,bP＜0.05。

组别 鼠数 肌酐(μmol/L) 尿素氮(mmol/L)正常对照组10 16.86±4.02 8.79±1.58模型组 10 30.93±6.16a 14.88±3.30a糖肾宁组 10 21.20±3.37b 11.47±2.44b缬沙坦组 10 21.56±3.93b 11.58±2.60b

2.2 糖肾宁对KK-Ay小鼠肾小球细胞外基质增生的影响

使用PAS染色观察各组小鼠肾组织细胞外基质增生情况。与正常对照组相比,模型组小鼠肾小球肥大,细胞外基质出现增生；与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠肾小球减小,细胞外基质增生减轻。提示糖肾宁能够减轻KK-Ay小鼠肾小球细胞外基质增生。见图1。

图1 各组小鼠肾小球细胞外基质增生比较(×400)

2.3 糖肾宁对KK-Ay小鼠肾小球细胞外基质蛋白Collagen I及FN蛋白表达的影响

应用免疫组化检测各组小鼠肾组织细胞外基质蛋白Collagen I及FN蛋白表达情况。与正常对照组相比,模型组小鼠肾小球细胞外基质蛋白Collagen I及FN蛋白表达明显增加；与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠Collagen I及FN蛋白表达明显减少。提示糖肾宁能够减少KK-Ay小鼠肾小球细胞外基质蛋白Collagen I及FN蛋白表达。见图2、表3。

图2 各组小鼠肾小球Collagen I蛋白(A)及FN蛋白(B)水平比(×400)

表3 各组小鼠肾组织Collagen I及FN蛋白表达水平比较(±s)

表3 各组小鼠肾组织Collagen I及FN蛋白表达水平比较(±s)

注：与正常对照组相比,aP＜0.05；与模型组相比,bP＜0.05。

组别 鼠数 Collagen I蛋白(IOD)FN蛋白(IOD)正常对照组10 19.75±7.68 34.21±6.68模型组 10 270.73±23.33a 112.49±20.92a糖肾宁组 10 120.27±18.63b 74.46±9.56b缬沙坦组 10 150.07±23.61b 64.05±10.21b

2.4 糖肾宁对KK-Ay小鼠足细胞EMT标志蛋白P-cadherin及FSP-1蛋白表达的影响

应用WB检测各组小鼠肾组织P-cadherin蛋白及FSP-1蛋白表达情况。实验结果显示,与正常对照组相比,模型组小鼠肾组织P-cadherin蛋白表达明显下调(P＜0.05),FSP-1蛋白表达明显上调(P＜0.05)；与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠肾组织P-cadherin蛋白表达明显上调(P＜0.05),FSP-1蛋白表达明显下调(P＜0.05)。实验结果表明,糖肾宁能够上调KK-Ay小鼠足细胞表型标志蛋白P-cadherin表达,下调间充质表型标志蛋白FSP-1蛋白表达。见图3、表4。

图3 各组小鼠肾组织P-cadherin蛋白及FSP-1蛋白水平比较

表4 各组小鼠肾组织P-cadherin及FSP-1蛋白表达水平比较(±s)

表4 各组小鼠肾组织P-cadherin及FSP-1蛋白表达水平比较(±s)

注：与正常对照组相比,aP＜0.05；与模型组相比,bP＜0.05。

组别 鼠数 P-cadherin蛋白(灰度值)FSP-1蛋白(灰度值)正常对照组4 1070.86±138.92 477.12±74.97模型组 4 218.93±65.84a 1336.38±193.72a糖肾宁组 4 565.43±87.71b 692.44±99.23b缬沙坦组 4 750.94±96.19b 703.29±98.52b

2.5 糖肾宁对KK-Ay小鼠足细胞EMT标志蛋白P-cadherin及FSP-1基因mRNA转录水平的影响

应用RT-PCR检测各组小鼠肾组织P-cadherin及FSP-1的mRNA表达情况。实验结果显示,与正常对照组相比,模型组小鼠肾组织P-cadherin的mRNA表达明显下调(P＜0.05),FSP-1的mRNA表达明显上调(P＜0.05)；与模型组相比,糖肾宁组及缬沙坦组小鼠肾组织P-cadherin的mRNA表达明显上调(P＜0.05),FSP-1的 mRNA表达明显下调(P＜0.05)。提示糖肾宁能够上调KK-Ay小鼠足细胞表型标志蛋白P-cadherin的mRNA表达,下调间充质表型标志蛋白FSP-1的mRNA表达。见表5。

表5 各组小鼠肾组织P-cadherin及FSP-1的mRNA表达水平比较(±s)

表5 各组小鼠肾组织P-cadherin及FSP-1的mRNA表达水平比较(±s)

注：与正常对照组相比,aP＜0.05；与模型组相比,bP＜0.05。

P-cadherin mRNA FSP-1 mRNA正常对照组组别 鼠数5 1.03±0.04 1.04±0.06模型组 5 0.26±0.05a 1.83±0.08a糖肾宁组 5 0.78±0.07b 1.36±0.04b缬沙坦组 5 0.74±0.05b 1.38±0.04b

3 讨论

DN的发病率逐年升高,已经成为严重威胁人类健康和生命的重大疾病。DN是欧美发达国家终末期肾脏病的首要病因[1],在中国DN导致终末期肾脏病的比例也越来越高[2]。研究发现,DN肾小球Collagen I及FN等基质蛋白明显增加,而肾小球细胞外基质增生是DN特征性的病理改变[3]。肾小球细胞外基质增生会引起肾脏结构及功能异常,导致蛋白尿的产生及肾小球硬化。因此减轻肾小球细胞外基质增生可以有效地延缓DN疾病的进展。足细胞EMT在DN肾小球细胞外基质增生过程中发挥着重要作用[4]。足细胞是一种肾小球上皮细胞,但当受到转化生长因子-β、高糖等损伤性刺激时会启动EMT的过程。足细胞EMT时其上皮细胞标志蛋白P-cadherin会向N-cadherin转变,并且会特异性的表达FSP-1蛋白[7]。此外足细胞会发生一系列表型改变,如细胞骨架重构、足突融合消失,细胞间连接破坏、裂孔隔膜消失,纺锤形的细胞形态消失,转变为鹅卵石形状[8]。最终足细胞会转变成为肌成纤维细胞,特异性地分泌Collagen I及FN等基质蛋白,引起肾小球细胞外基质增多及肾小球硬化。做足细胞EMT介导的肾小球细胞外基质增生是DN的重要病理机制,但是目前却缺少针对性的治疗措施。

中医药在DN防治方面具有独特的优势,并且显示出其多靶点效应。DN病程长,在不同的疾病阶段其中医病因病机也有所不同,应分期论治。笔者根据多年的临床经验认为：DN早期病位主要在肝肾,主要病机为肝肾气阴两虚、肾络瘀滞；中期病位主要在脾肾,主要病机为脾肾气阳两虚、肾络瘀阻；晚期病位主要在肾、肝、脾三脏,主要病机为气血阴阳衰败、浊毒内停、肾络瘀结[9]。针对DN早期的病机,运用益气养阴、化瘀散结法进行治疗。糖肾宁是在益气养阴、化瘀散结的治则指导下研制的中药制剂,临床实验证实,糖肾宁具有降低DN早期患者蛋白尿、改善肾功能的作用[10]。此外基础实验证实,糖肾宁可以上调DN足细胞Nephrin蛋白表达、减轻足细胞损伤[11]。

本实验观察了糖肾宁对KK-Ay小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影响,提示糖肾宁能够降低KK-Ay小鼠血清肌酐、尿素氮水平,下调KK-Ay小鼠肾小球基质蛋白表达,减轻细胞外基质增生,上调KK-Ay小鼠足细胞P-cadherin蛋白表达,下调FSP-1蛋白表达。本研究结果表明,糖肾宁能够抑制DN小鼠足细胞EMT,减轻肾小球细胞外基质增生,但其抑制DN足细胞EMT的具体分子机制有待进一步研究。