光照强度对菌藻共生生物膜细菌群落结构的影响

朱 林，车 轩※，刘兴国，刘一萌，刘 晃，陈晓龙

（1. 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所 上海 200092；2. 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海 200090）

0 引 言

随着中国现代经济的高速发展和人口剧增，水体富营养化、重金属及抗生素水体污染已成为中国最为关注的环境问题之一[1]。传统的物理处理法效率低，处理不彻底且能耗较大；化学处理法使用的试剂一般具有毒性，会对环境造成二次污染[2]。生物处理法符合自然生态原则和环境友好型宗旨，成为近年来的发展趋势。常用的生物处理方式主要有菌藻共生系统、单独藻类系统和单独细菌系统，单独藻类系统由于过度消耗CO2，pH 值一般达到9 以上，pH 值过高会抑制一般微生物的生长，且不利于水的再利用；单独细菌系统有污染物耐受能力低的缺陷。而菌藻共生系统能克服以上2 个缺点[3]。

对于一般的生物处理来说，曝气所需的成本占到整个处理的50%左右[4]，细菌和微藻的协调作用不仅提高氮磷的去除效果，还能省去曝气操作，因此，利用菌藻共生系统来处理废水能大幅降低运行成本。此外，有机物降解所产生的二氧化碳被微藻吸收后，减少了温室气体排放，这也是传统好氧处理法不具备的优势之一[5]。菌藻共生系统研究始于20 世纪50 年代末，Oswald 等报道了氧化塘中藻菌共生和藻类光合放氧等现象，提出了利用高效藻类塘处理污水的新工艺[6]。先后发展出悬浮菌藻系统、固定化菌藻系统及菌藻生物膜系统[7]，其中菌藻生物膜系统利用微藻本身易于附着的特性，附着在载体表面，生物膜易于形成，优势菌种和藻类不易流失，处理效果优于悬浮菌藻系统，且成本较低，比其他2 种菌藻共生系统更具优势[8-10]。

微藻与细菌之间的相互作用较为复杂，作用形式多种多样，既包括相互利用代谢产物的互利共生关系，也包括对营养物质的相互竞争和抑制关系[11-12]。如果环境中的营养物质不能够满足细菌和微藻共同生长需要时，细菌和微藻就会产生对营养物质的相互竞争[13-15]。同时，在黑暗环境中微藻的呼吸作用也会吸收环境中的氧气，从而与细菌产生对氧气的竞争。“菌藻共生”是指将细菌对污水中污染物的降解能力与藻类吸收去除污水中N、P 和有机物的功能结合在一起[16]，如何利用菌藻之间的互利共生关系更好的构建菌藻系统是提高其水处理效果的关键。关于菌藻共生体与光的关系，研究人员做了不少工作，包括光穿透和混合不足导致细菌呼吸和微藻光合产氧之间失衡、通过膜光生物反应器收获藻体、利用闭合反应器来解决菌藻共生系统中捕食者的问题等[17-19]。但尚未见光照强度与菌藻共生生物膜细菌群落关系的报导，因此笔者选择了不同光照强度水平作为研究切入点。本试验构建了3 组生物膜反应器，设置3 种不同的光照强度，对3 组菌藻共生生物膜的水质数据及细菌群落进行监测和分析，以期为菌藻关系研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 生物膜光反应器

于农业部渔业装备与工程重点开放实验室内建设3组生物膜光反应器如图1 所示，系统主要由蓄水池，生物膜反应床及冷暖水机3 大部分组成，面积0.5 m2（长1.016 m，宽0.46 m），水层厚度2 cm，由6 mm 厚的PVC板制成。生物膜反应器上方30 cm 设置5 个日光灯（光照强度0～8 000 lx，可调），下方放置生物膜挂膜载体。反应器前设置容积100 L 的进水池，由水泵驱动进水，流量5 L/h，水力停留时间2 h。通过冷暖水机将整个试验过程水温控制在25 ℃。CK 组、T1 组及T2 组光照强度依次设置为0，4 750 lx，7 580 lx，每组3 个重复。

图1 试验系统3D 示意图 Fig.1 Three-dimensional schematic diagram of test system

1.2 人工配水反应器接种

试验采用醋酸和人工废水配置碳氮比为1∶1 模拟养殖废水，分别在3 组试验系统中进行反应器驯化。废水营养盐成分为 NH4Cl 38.5 g/m3、NaHCO33 g/m3、MgSO4·7H2O 0.5 g/m3、MnSO4·H2O 0.15 g/m3、K2HPO47.4 g/m3、FeCl3· 6H2O 0.2 g/m3。系统启动后，进行微藻和细菌接种。微藻接种液为淡水池塘养殖水，蓝藻为优势种，接种量100 mL，细菌接种液为淡水养殖池塘底泥，变形菌门为优势种，接种量5 g。

1.3 水质测定方法

试验过程中，使用水质多参数分析仪（YSI6920）测定水体等理化特征，主要包括水温、溶氧（Dissolved Oxygen，DO）、pH 值、氧化还原电位等。使用多参数水质分析仪（HACH DR-2800）及萘乙二胺分光光度法、纳氏试剂分光光度法及紫外分光光度法分别测定亚硝态氮（NO2--N）、氨氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3--N）。

1.4 样品预处理及总DNA 提取

待生物膜成熟后，用灭菌手术刀将载体上的生物膜刮下，注入PBS 缓冲液，高速涡旋振荡5 min，反复操作10 次，收集水样，将水样在15 000 r/min 下离心15 min，取沉淀物用于总DNA 提取，采用E. Z. N. A. ® Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，GA，U.S.）按照试剂盒上的说明书进行提取，提取的DNA 用TE 缓冲液（10 mmol /L Tris-HCl，1 mmol /L EDTA，pH 值8.0）溶解，并用NanoDrop® 2000（Thermo Scientific，USA）测定DNA含量及质量，最后保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.5 样品测序

采 用 细 菌 通 用 引 物 338F（ 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ ） 和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对样品16S RNA的V3～V4 区域进行扩增[20]，PCR 扩增体系（共20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），FastPfu Polymerase 0.4 μL，DNA 模板10 ng，用灭菌超纯水补足至20 μL，PCR 反应在ABI GeneAmp ® 9700 扩增仪上进行。PCR 反应条件：95 ℃下预变性3 min；55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸45 s，共进行28 个循环；最后在72 ℃下再延伸10 min。

扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳测定，采用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.）切胶回收PCR 产物，使用QuantiflourTM-ST蓝色荧光定量系统（Pro-mega，U.S.）定量。使用TruSeqTMDNA Sample PrepKit 试剂进行MiSeq 文库构建，最后由上海美吉生物医药有限公司进行测序。

1.6 数据处理与统计分析

基于SPSS 18.0 软件，利用One-way ANOVA，对不同处理的水质参数和细菌门属分类水平的相对丰度进行单因素方差分析；采用QIIME Pipeline Version 1.8.0 进行序列拆分和质量控制[21-23]，使用UCLUST 序列比对软件，控制阈值为97%的序列相似度作为OTU划分标准，合并划分OTU，并剔除丰度值低于0.001%的OUT，所有OTUs 通过与SILVA（SSU123）16S rRNA 数据库进行比对后确定其微生物归类[22]。利用Mothur 软件构建稀释性曲线（rarefaction curve）[23]，并计算Shannon 指数及Chao1 指数[24]。

2 结果与讨论

2.1 氨氮浓度、亚硝氮及硝氮浓度变化趋势

CK 组、T1 组及T2 组光反应器系统水质变化趋势分析如图2 所示，图2 表示的是CK 组、T1 组及T2 组氨氮浓度变化趋势，CK 组、T1 组及T2 组试验启动时氨氮浓度都是 10 mg/L，在第 7 天 T2 组氨氮浓度降到(0.8±0.14) mg/L，此时CK 组及T1 组氨氮浓度分别为(3.8±0.46)、(5.98±0.89) mg/L。图2a 所示的是CK 组、T1 组及T2 组系统亚硝氮浓度变化趋势，第7 天时CK组亚硝氮浓度升到(7.62±1.25)mg/L，此时CK 组及T1组亚硝氮浓度分别为(5.76±0.86) L、(2.34±0.45) mg/L；CK 组在第12 天时亚硝氮浓度率先降到0 mg/L，CK 组在第14 天亚硝氮浓度率先降到0，CK 组在第16 天亚硝氮浓度率先降到0。图2c 所示的是CK 组、T1 组及T2组系统硝氮浓度变化趋势，均呈上升趋势，其中，CK组、T1 组及T2 组系统硝氮浓度最高值达到(59.3±8.36)、(35.8±4.76)及(24.9±3.62) mg/L。试验启动时CK 组、T1组及T2 组系统硝氮浓度均为(0.32±0.01) mg/L，第2 天CK 组菌藻共生生物膜系统硝氮浓度升到(11.28±1.35) mg/L，此时T1 组及T2 组硝氮浓度分别为(2.93±0.36)、(2.96±0.41) mg/L。

图2 菌藻共生生物膜细菌群落氨氮、亚硝氮及硝氮浓度变化曲线 Fig.2 Change curve of ammonia nitrogen, nitrite, nitrogenous concentration in bacterial community of symbiotic biofilm of bacteria and algae

2.2 16S rDNA 测序分析

2.2.1 Alpha-多样性分析

不同光照处理的Alpha 多样性指数变化关系如表1 所示。各处理的覆盖率均大于98%，说明本次试验获得的细菌序列覆盖度较好，其测序深度可以满足细菌群落结构组成及多样性分析。总体可以看出，T1 处理和T2 处理的Alpha 多样性指数，包括获得的OTUs 数量（498.5±7.16、517.2±10.36）、Chao1 指数（648.7±35.64、672.8±30.69）和Shannon 指数（4.68±0.01、4.85±0.03）均显著高于CK处理（406.6±8.18，521.5±18.62，3.53±0.02）。该结果表明，无光处理降低了生物膜细菌多样性指数，CK 组菌藻生物膜的细菌群落在总体数量上处于弱势，显著低于处理T1 和T2，菌藻生物膜的细菌群落数量随着光照强度的升高而增加。Mandal 等发现前环藻（Amphidinium carterae）分泌的胞外聚合物可以促进枯草芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的生长[25]。在森林生态系统中，因为微生境环境因子的改变，林隙微生物的代谢途径得到了提升[26]，微生物种类增多，尤其是r 策略种[27]。本次试验中，随着光照强度增强，菌藻生物膜细菌群落在总体数量上处于升高趋势，可能是微藻光合作用过程中产生的氧气或有机物诱导细菌需氧生长，形成宜于菌群繁殖所需的适宜环境，进而促进了生物膜菌群的活动。本次的试验发现，间接佐证了关于光照强度的提高导致微生物多样性升高的研究结果[28]。 注：OUT：可操作分类单元；同行数据后不同字母表示差异显著（P<0.05）。 Note： OTU： operational taxonomic units; Different letters after peer data indicate significant difference.

表1 3 个处理细菌群落Alpha-多样性指数分析 Table 1 Analysis of Alpha-diversity index of bacterial community in three treatments

2.2.2 3 种不同光照强度组菌藻生物膜优势细菌门水平丰度分析

3 种不同光照强度组菌藻生物膜优势细菌门水平的变化如表2 所示，由该表可知，本试验中，不同光照强度下的菌藻生物膜细菌群落结构发育对不同的微生态环境有不同的响应。CK 组菌藻生物膜所含细菌种类表现为变形菌门（Proteobacteria）占绝对优势，拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和放线菌门（Actinobacteria）其次，酸杆菌门（Acidobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）弱势；随着光照强度的增加，菌藻生物膜的优势细菌类群所占百分比的次序发生了改变，T1 组变形菌门、拟杆菌门及绿弯菌门占优，蓝细菌门（Cyanobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）和放线菌门其次，酸杆菌门、疣微菌门和硝化螺旋菌门弱势；T2 组蓝细菌门、拟杆菌门及绿弯菌门占优，变形菌门和浮霉菌门其次，放线菌门及酸杆菌门弱势。

CK 组菌藻生物膜变形菌门丰度平均值为32.92%±2.65%，显著高于T1 组（21.89%±3.25%）及T2组（15.28%±3.60%），表明光强对变形菌门有抑制作用，菌藻生物膜变形菌门的丰度随着光照强度的增强而减少，差异显著（P<0.05）；T1 组拟杆菌门丰度为18.72%±2.48%、T2 组拟杆菌门丰度为19.78%±4.69%，2组差异不显著，CK 组拟杆菌门丰度为14.24%±1.89%，显著低于T1 组和T2 组（P<0.05）；CK 组绿弯菌门丰度13.34%±3.73%，显著低于T1 组（17.57%±3.57%）和T2组（18.77%±3.14%）（P<0.05）；CK 组及T1 组硝化螺旋菌门丰度分别为2.61%±0.53%和2.45%±0.34%，显著高于T2 组（0.94%±0.1%）；T1 和T2 组放线菌门丰度水平没有差异，但两者与CK 组差异显著；CK 组蓝细菌门丰度（1.59%±0.52%），显著低于T1 组（9.24%±1.2%）和T2 组（20.03%±1.03%），且后两者差异显著（P<0.05）。

在森林生态系统中，林隙通过控制林内光照强度[29-30]，影响微生物的代谢[26,28]，继而微生物群落结构等对环境的变化产生响应。本次试验得到了类似的试验结果，随着光照强度的改变，菌藻生物膜细菌群落优势种在门水平丰度上有显著差异。研究发现能将土壤中的亚硝酸氧化成硝酸盐的硝化螺旋菌门（Nitrospirae）[31]在T1 处理和CK 处理中的相对丰度显著高于T2 处理，具有污染物降解功能的芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）[32]在T1 处理中的相对丰度显著高于CK 处理，CK 处理显著高于T2处理，在证明3 个处理生物膜中存在不同程度的硝化过程，不同光照强度组菌藻生物膜细菌群落结构存在显著差异，因对光照等需求的差异，不同光照强度形成的微生态环境对菌藻生物膜菌群的群落发育过程有重要的作用。

表2 3 个处理细菌群落门水平的组分丰度 Table 2 Component abundances at the gate level of three treatments

2.2.3 3 种不同光照强度组菌藻生物膜细菌优势种属水平丰度分析

为深入分析不同光照强度对菌藻生物膜细菌群落结构的影响，根据CK 组和T1、T2 3 个处理组的菌群群落属相对丰度组成数据，通过与silva（SSU123）数据库进行比对，共鉴定出480 个微生物属，图3 显示了3 组处理细菌百分比大于1%的属。由图可知，CK 处理相对丰度最高的细菌为腐螺旋菌科（norank_f_Saprospiraceae（5.53%±0.62%），T1 处理相对丰度最高的细菌为红杆菌属（Rhodobacter，6.16%±1.38%），T2 处理相对丰度最高的细菌为分歧壶菌科（Cladochytriaceae，10.50%±1.38%）。

与微藻共培养的菌体能为微藻生长提供维生素[33-35]，还能固定无机营养素。Amin 等[36]报道，Scrippsiella trochoidea能够利用细菌在环境中产生铁载体，从而提高水处理效率。硝化是指硝化细菌在好氧的条件下首先将氨氮转化为亚硝酸盐氮（NO2-），生成的亚硝态盐氮快速被亚硝酸盐氧化菌转化成硝酸盐氮（NO3-）的过程；反硝化是指异养反硝化菌在缺氧条件下将亚硝酸盐或硝酸盐转化成氮气的过程，通过硝化和反硝化达到脱氮的目的，是重要的水污染控制技术之一[37]，本次试验中，硝化螺菌属（Nitrospira）在CK 组和T1 处理的属水平相对丰度为2.72%±0.93%和2.57%±0.46%，显著高于T2 组；3 个处理生物膜中存在大量的以Pseudomonas（假单胞菌属）和Rhodobacter（红杆菌属）为主体的含有反硝化细菌的科属，其中，假单胞菌属中的部分种属于好氧反硝化细菌[38]，这些菌在好氧条件下能够以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮为底物进行反硝化[39]，在本研究中，红杆菌属相对丰度随着光照强度的增大而逐渐升高，T1 组假单胞菌属的相对丰度平均值显著高于CK 组及T2 组，可见T1组系统的硝化和反硝化功能优于CK 组及T2 组。

董怡华[40]研究发现菌株PSB-1D 在黑暗条件下比在光照强度4 000 lx 条件下对2-氯苯酚的7d 降解率高出12.12%；罗龙皂[5]进行不同光照强度下细菌降解废水中有机物的试验，结果表明：光照强度400 lx 是有机物降解菌适宜的工作条件。朱章玉等[41]报导PSB 在好氧黑暗条件下要比在厌氧光照条件下对有机酸具有更高的去除率和菌体得率。本试验中，Paenarthrobacte是一种好氧生长的球形放线菌，可以利用多种碳源，并且可以水解淀粉类物质[42]，其在 CK 组的属水平相对丰度为4.2%±1.07%，显著高于T1 处理（3.56%±1.36%）和T2处理（1.59%±1.46%）；Ensifer（剑菌属）是一种好氧生长的杆状变形菌，能够利用包括葡萄糖、半乳糖在内的多种碳源，不能水解淀粉，具有硝酸盐和亚硝酸盐还原能力，能够附着在其他细菌表面并使其裂解，是一种非专性捕食性细菌[43]，剑菌属在CK 组的属水平相对丰度为4.6%±1.27%，显著高于T1 处理（3.53%±1.25%）和T2 处理（1.87%±0.4%），说明CK 处理菌藻生物膜在降解多种有机物的能力方面强于T1 组和T2 组。

图3 菌藻生物膜细菌优势种属水平群落组成分析 Fig.3 Community composition analysis of dominant species and genera of Bacillariophyta biofilm bacteria

3 结 论

1）对3 种不同的光照强度下的菌藻共生生物膜细菌群落进行了16S rDNA 测序，对结果进行了Alpha-多样性分析，结果表明T1 处理和T2 处理的Alpha 多样性指数，包括获得的OTUs 数量（498.5±7.16、517.2±10.36）、Chao1 指数（648.7±35.64、672.8±30.69）和Shannon指数（4.68±0.01、4.85±0.03）均显著高于CK 处理（406.6 ± 8.18，521.5±18.62，3.53±0.02），无光处理的菌藻生物膜的细菌群落在总体数量上处于弱势，菌藻生物膜的细菌群落数量随着光照强度的升高而增加。

2）对3 种不同的光照强度下的菌藻共生生物膜细菌群落进行了16S rDNA 测序，对结果进行了细菌优势种门属水平丰度分析，变形菌门（Proteobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和放线菌门（Actinobacteria）在3 个处理中均为优势菌种，但丰度有显著差异，CK 处理的酸杆菌门（Acidobacteria），T1处理的芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）及T2 处理的蓝细菌门（Cyanobacteria）均具有较高丰度，且显著高于其他两组。不同光照强度下的菌藻生物膜细菌群落结构发育对不同的微生态环境有不同的响应，随着光照强度的变化，菌藻生物膜的优势细菌类群所占百分比的次序发生改变。T1 组具有较高水平的假单胞菌属和硝化螺菌属，拥有较高的硝化和反硝化能力，CK 组在剑菌属水平显著高于T1 组和T2 组，在降解多种有机物的能力方面较强。