长顺绿壳蛋鸡早期发育在酶作用下性逆转研究

李兴美,何 勇,李兴芳,李志惠,程德元,侯晓琪

(1.贵州农业职业学院,贵州贵阳 551400；2.贵州师范学院,贵州贵阳 550018；3.遵义市中医院,贵州遵义 563000)

贵州长顺县绿壳蛋鸡具有优良的蛋肉品质和宝贵的遗传资源（潘周雄等，2008）。2008年长顺县绿壳鸡蛋通过省无公害农产品和产地认证，2012年通过国家有机产品认证，2014年获得农业部地理标志认证（孙鹃等，2014）。因此，长顺县绿壳蛋鸡是贵州长顺地区精准脱贫攻坚的重要发展产业，也是地方区域经济发展的支柱产业。

为了提高生产力，人们已在禽性别控制方面作了一定研究。1974—1979年马焰（译）对来航品系鸡后代雌雄性别进行研究，在未做任何处理的情况下，对不同后代鸡性比的遗传变异情况进行统计，在正常遗传繁育中，鸡的雌雄性比遗传变异不显著，公鸡比例平均为50.9%，母鸡比例平均为49.1%，雌雄遗传性比比较平稳（马焰，1980）。因此，不可能选出某一优势性别作为繁育种用鸡，但对鸡性别的人工干预也有部分研究，如易治明和张志霞（1986）在鸡性别控制研究方法中使用雌激素和鸡睾丸匀浆制备的抗睾丸血清，用于人工干预孵化过程中鸡胚性别，虽然最后获得一定效果，但并不理想，雌性鸡比例虽较高，但小鸡孵化率极低，其效果并不显著。张静蓉和陈忠（2013）在鸡性别决定与控制技术的研究进展中阐明，鸡的性别可能是由Z 染色体和W 染色体决定，但这只是一种假说，最后具体实验验证和生产验证也未见报道。鸡的性别分化与生物调节剂相关，在鸡胚性别分化期与芳香化酶表达高度相关，可能起活化芳香化酶转录作用，参与调节芳香化酶合成，对雌激素分泌进行间接调节（GOVOROUN 等，2004）。CYP19A1（cytochrome P450 19A1）编码合成芳香化酶，进而合成雌激素，因鸟类发育受激素影响较大，故该基因是鸟类卵巢分化关键因子。其表达始于孵育后6.5 d，符合性腺强烈分化时期，用芳香化酶抑制剂处理性腺尚未分化的雌性鸡胚（ZW），可诱导雌性向雄性的性反转（ELBRECHT 和 SMITH，1992）。但利用芳香化酶抗体调节作用控制长顺绿壳蛋鸡的性别分化还未见报道，因此，本文对此进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料 种蛋购于贵州省绿壳蛋鸡的发源地，即贵州省长顺县鼓扬镇联富绿壳蛋鸡养殖合作社，购买时间为2018年5月至2019年5月。

1.2 试剂及仪器 主要试剂：芳香化酶抗体50ul/瓶，稀释液 Tris-HCl，pH=7.4，100 mL/瓶，高锰酸钾、甲醛，均购自上海博湖生物科技有限公司。

仪器设备：双系统全自动孵化机DZ47-63，1584 个，购自山东省德州市德城区召鹏孵化设备厂

1.3 试验方法

1.3.1 种蛋的选择 一般选择生产1 周之内的新鲜蛋种蛋，清洁度、大小、蛋形、蛋壳颜色都符合种用要求。

1.3.2 孵化机的消毒 采用熏蒸消毒法，高锰酸钾与甲醛按一定比例混合，高锰酸钾的需要量为15 g/m3，甲醛的需要量为30 mL/m3，孵化机总空间体积为0.70 m3，高锰酸钾为10.50 g，甲醛为21 mL，将两者混合后放入孵化机中，然后将孵化机关闭，关好窗户和门迅速离开。待清毒30 min后打开门、窗户和孵化机，通风换气2.5 d，排净孵化机中的甲醛气体。

1.3.3 种蛋的消毒 采用喷雾法进行种蛋消毒，配制0.1% 的新洁尔灭水溶液，取5% 新洁尔灭原液，加5 倍40℃的温水，将配成液用喷雾器喷洒到种蛋表面5 min，晾干后送孵化机中入孵。

1.3.4 试剂的配制 芳香化酶抗体与稀释液以1 ∶1000 的比例进行稀释。

1.3.5 芳香化酶的作用机理 芳香化酶是一种生物调节剂，可催化睾酮最左边的一个不规则六圆环，使最左边的双键打开，其结构变为带有一个羟基的苯环，即睾酮转变为雌二醇。（如图1 所示）

1.4 试验的过程

1.4.1 受精蛋的处理 将孵化第 4、5、6、7 天的种蛋进行照蛋，受精率约为81%，选择发育良好的受精蛋，然后进行两种处理。

1.4.2 胚内处理法 孵化至第4 天照蛋，选出血管发育良好的胚蛋，分别对孵化第 4、5、6、7 天的胚蛋进行处理，即在尿囊区避开大血管处打一小孔，注入已稀释好的芳香化酶抗体稀释液，注入剂量分别为 0.05、0.10、0.15、0.20 mL，每天每剂量注入胚蛋为80 个，最后再用蜡液化封住小孔，再返回孵化机继续孵化。

1.4.3 胚外处理法 孵化至第4 天照蛋，选出血管发育良好的胚蛋，分别对孵化第 4、5、6、7 天的胚蛋进行处理，将预先准备好的消毒棉固定在胚蛋外面，再将已配制好芳香化酶抗体稀释液注射到蛋外消毒棉中，以保证稀释液能较好的浸入胚中，注入剂量分别为 0.05、0.10、0.15、0.20 mL，每天每剂量注入80 个受精蛋，最后再返回孵化机继续孵化。

1.4.4 孵化条件 温度为37.80℃，湿度为60%左右，最后3 d 湿度为75% 左右。

1.5 统计与分析 试验数据采用SPSS22.0 软件进行处理，并进行多重比较，对不同处理之间的差异性进行分析。

2 结果与分析

2.1 胚内处理结果

2.1.1 成活率的分析 由表1 可知，胚内注射芳香化酶抗体稀释液，孵化后小鸡成活率较低，平均成活率只有9.06%，死亡率高达90.94%。其中成活率最高为17.50%，最低为5.00%。通过统计分析发现，不同剂量处理之间的F=0.39，差异性不显著（P＞0.05），表明各处理组对小鸡的成活率影响不明显；总体分析表明，不同日龄处理之间F=8.72，差异显著（P＜ 0.05），但第 4、5、7 天之间差异性不显著。

2.1.2 雌雄鸡性比的分析 由表2 可知，通过胚内处理后，孵化成活雏鸡中母鸡比例较高，平均高达92.80%，公鸡所占比例平均为7.20%。其中，母鸡最高达到100%，最低为71.40%。通过方差分析，不同剂量处理之间的F=0.13，差异性不显著（P＞0.05），表明不同剂量对母鸡百分比效果不明显；不同日龄处理之间的F=0.82，差异性不显著（P＞0.05），表明不同日龄处理对母鸡百分比效果不显著。

表1 不同日龄不同剂量胚内处理对雏鸡成活率的影响

表2 不同日龄不同剂量胚内处理对性别比的影响

2.2 胚外处理结果

2.2.1 成活率的分析 由表3 可知，采用胚外注射芳香化酶的抗体稀释液，雏鸡成活率较高，成活率平均为90.27%，死亡率平均为9.73%。其中，成活最高为100%，最低为80%。经分析得出：在不同剂量之间F=0.29，差异性不显著（P＞0.05），不同剂量处理对雏鸡成活率影响不显著；总体分析不同日龄处理之间F=17.96，差异性极显著（P＜ 0.01），但第 4、5、7 天之间差异性不显著（P＞ 0.05）。

表3 不同日龄不同剂量胚外处理对成活率的影响

2.2.2 雌雄鸡性比的分析 由表4 可知，通过蛋外处理后，最后得出雌性平均为72.82%，雄性平均为27.18%，其中最高为80.77%，最低为66.67%。通过总体分析表明，不同剂量之间处理，F=2.76，差异性不显著（P＞ 0.05），不同剂量处理对雌性的百分比效果不明显；不同日龄之间处理，F=25.24，差异性极显著（P＜ 0.01）。

表4 不同日龄不同剂量胚外处理对雌雄性比的影响

3 讨论

3.1 胚内处理的成活率与雌雄性比 通过采用芳香化酶抗体稀释剂胚内注射，雏鸡成活率极低，平均只有9.06%，不同日龄胚内处理与雏鸡成活率之间的差异显著（P＜0.05），不同剂量处理与成活率之间的差异性不显著（P＞0.05），这说明注射日龄对小鸡成活率有一定影响，不同剂量试剂注射对小鸡成活率无显著影响。在孵化过程中，前期发育较好，后期即出雏前4 d 左右，胚胎死亡逐渐升高。待出雏后将成活雏鸡饲养至完全能辨别雌雄，雌性百分比为92.80%，雄性为7.20%。这与易治明和张志霞（1986）的研究结果相似，即将雌激素和抗睾丸鸡血清制备液注入胚蛋中，68个胚蛋孵化仅成活9 只小鸡，成活率为13.2%，但9 只小鸡全部为雌性，雌性百分比为100%。说明胚蛋打孔注射对胚胎发育有较大影响，雏鸡成活率较低。

所以，早期胚内注射芳香化酶抗体稀释液对鸡胚成活率及雌性比例的影响因素可能：一是胚蛋打孔后会受到外环境影响，打破胚内环境的平衡；二是芳香化酶抗体注入后反应太强烈，脆弱的鸡胚难以适应。酶是一种量少功能强大的调节剂，所以，在孵化过程中有可能是雄性鸡都被致死，而成活的只是母鸡，也有可能部分是雄性鸡逆转成雌性鸡。因此，胚内处理方式的代表性不强，成活母鸡并不能代表是雄性逆转获得的。

3.2 胚外处理的成活率与雌雄性比 芳香化酶抗体稀释剂胚外注射，雏鸡成活率较高，平均为90.27%，死亡率较低，平均为9.73%。不同剂量处理对雏鸡成活率差异性不显著（P＞0.05），不同日龄胚内处理与雏鸡成活率间差异极显著（P＜0.01）。胚外处理成活雏鸡养至完全能辨别雌雄，母鸡比例平均为72.82%，公鸡的平均为27.18%，不同剂量处理母鸡的百分比差异性不显著（P＞0.05），不同日龄之间处理母鸡百分比差异性极显著（P＜ 0.01）。

所以，虽然胚外处理母鸡的比例为72.82%，与胚内处理母鸡的比例为92.80% 要低些，但胚外处理的成活率较高，这可能是因为胚外处理对胚内环境没有太大改变，胚外固定消毒棉注射芳香化酶抗体稀释液，主要是通过外壳缓慢浸润至胚内，对胚胎发育不可能达到致死程度。根据马焰（译）（1980）对来航品系鸡后代雌雄性别进行研究，正常遗传繁育中鸡雌雄性比遗传变异比例不显著，公鸡比例平均为50.9%，母鸡比例平均为49.1%。本研究结果发现，母鸡比例平均为72.82%，公鸡比例平均为27.18%。这说明芳香化酶抗体对鸡胚的发育确实起一定作用，胚外注射芳香化酶抗体稀释液对鸡性别发生了逆转。而且胚外处理比胚内处理效果好，在孵化第6 天时胚外注射芳香化酶抗体试剂鸡胚有雄性鸡向雌性鸡的逆转改变。

4 结论

从试验结果可以看出，长顺绿壳蛋鸡早期胚胎发育的性逆转在芳香化酶抗体作用中起一定效果，胚外注射效果较好，但在性逆转机制方面还不清楚。在今后研究工作中还需进一步从分子水平思考长顺绿壳蛋鸡性别决定的基因，性别决定的影响因素，并从性逆转机制方面作相关探索。