硝态氮/亚硝态型厌氧甲烷氧化在污染控制中的应用进展与探索

卢培利，王学文，丁阿强，李微薇，熊敏，张代钧

（1 煤矿灾害动力学与控制国家重点实验室，重庆400044；2 重庆大学环境科学系，重庆400044）

硝态氮/亚硝态型厌氧甲烷氧化（NO-3/NO-2-dependent anaerobic methane oxidation，NOx-DAMO）是在厌氧条件下，微生物以硝酸盐（nitrate-dependent anaerobic methane oxidation，NO-3-DAMO）或亚硝酸盐（nitrite-dependent anaerobic methane oxidation，-DAMO）为电子受体，甲烷为电子供体的生物反应过程。驱动NOx-DAMO 的微生物包括细菌和古菌。NOx-DAMO 古菌通过反向产甲烷过程将甲烷转化为二氧化碳，同时将硝酸盐还原为亚硝酸盐，其模式种属为Candidatus Methanoperedens nitroreducens；NOx-DAMO 细菌通过内产氧途径将甲烷转化为二氧化碳，同时将亚硝酸盐还原为氮气，其模式种属为Candidatus Methylomirabilis oxyfera。NOx-DAMO 微生物在自然和人工生境中的广泛分布暗示了NOx-DAMO 过程在全球碳氮循环中的重要作用。

NOx-DAMO 过程可以利用甲烷作为电子受体替代传统废水处理投加的有机物，降低处理成本，同时，经NO歧化为N2，跃过了N2O产生过程，减少温室气体排放。因此，利用硝态氮型厌氧甲烷氧化过程脱氮协同去除废水中氮素与散逸的甲烷或将代替传统废水处理成为一种新工艺。尽管微生物富集困难、环境敏感和反应速度慢等对其应用潜力有限制，但基于NOx-DAMO原理，面向低C/N比废水，开发以甲烷替代外碳源的废水脱氮技术以及面向消化液中甲烷厌氧氧化的温室气体减排技术等尝试一直在进行。随着对NOx-DAMO 微生物生理生化特性认识的加深以及对NOx-DAMO 工艺影响因子的优化，研究者逐步开发了可有效提升氮转化和甲烷氧化速率的膜生物膜反应器（MBfR）、膜生物反应器（MBR）和颗粒活性炭等反应器与强化技术。目前NOx-DAMO 与厌氧氨氧化耦合工艺的脱氮负荷已达到了1kg/(m3·d)[1]，展示了工程应用潜力。

本文聚焦于NOx-DAMO 的工程应用这一技术视角，在概述NOx-DAMO 过程微生物及其代谢机制、环境分布和影响因素的基础上，重点对NOx-DAMO 应用的研究进展进行总结，包括反应器类型、处理对象、运行参数和反应速率等；最后，从温室气体减排角度出发，提出了将NOx-DAMO 作为生活垃圾填埋与煤层气开采所产生的不具有应用价值的甲烷的处理技术，以期拓宽NOx-DAMO 应用范围，推动基于NOx-DAMO的应用技术的开发。

1 NOx-DAMO过程的微生物学进展

1.1 NOx-DAMO过程的微生物及其机制

NOx-DAMO 过程是微生物将硝酸盐/亚硝酸盐与甲烷转化为氮气与二氧化碳的过程。2004 年Lslas-Lima 等[2]发现了NOx-DAMO 现象，但其功能微生物并不清楚。2006年Raghoebarsing 等[3]成功富集了NOx-DAMO 微生物，并推测古菌与细菌的协同作用。 2010 年NOx-DAMO 细菌被命名为Candidatus Methylomirabilis oxyfera[4]。随后Haroon等[5]确定了NOx-DAMO 古菌归属于ANME-2d，并命名为Candidatus Methanoperedens nitroreducens。目前发现的NOx-DAMO 细菌有Candidatus Methylomirabilis 属的Candidatus Methylomirabilis oxyfera、 Candidatus Methylomirabilis sinica[6]和Candidatus Methylomirabilis limnetica[7]3 种，古菌只有Candidatus Methanoperedens nitroreducens。NOx-DAMO过程的发现发展过程如图1所示。

古菌M.nitroreducen 以甲烷为电子供体将硝态氮还原为亚硝态氮，细菌M.oxyfera以甲烷为电子供体将亚硝态氮还原为氮气，分别如式(1)和式(2)所示。

细菌M.oxyfera 具有特殊的内产氧途径，首先NO-2在亚硝酸盐还原酶作用下被还原为NO，之后NO在一种假定的NO歧化酶（nitric oxide dismutase，NOD）作用下被歧化为N2和O2，但截至目前NOD仍未被证实。Ettwig 等[8]提出可能有两种与对苯二酚基一氧化氮还原酶同源的酶能将NO歧化为N2和O2，且此歧化过程是高放能过程。细菌M.oxyfera拥有完整的好氧甲烷氧化途径编码基因。利用内产氧过程产生的氧气，M.oxyfera首先通过颗粒状甲烷单加氧酶（particulate methane monooxygenase，pMMO）催化甲烷转化为甲醇，然后在3种PQQ型甲醇脱氢酶（PQQ-dependent methanol dehydrogenases，MDH）的作用下将甲醇氧化为甲醛；继而，甲醛可经高表达的H4MPT途径或者低表达的H4F途径羧化生成甲酸[9]；最后，3种酶[一种高表达的formyl-MFR脱氢酶和两种低表达的NAD(P)+依赖型甲酸脱氢酶]将甲酸氧化为CO2。

1.2 NOx-DAMO微生物的生境分布

NOx-DAMO微生物分布生境如表1所示。大多NOx-DAMO微生物存在于淡水环境中，如水稻土[16-17]、淡水河道底泥[16]、湿地[18]和泥炭地[19]等。各类含盐环境中也检测到NOx-DAMO 微生物的存在，如河口底泥[20]、海滨湿地[21]和海底沉积物[22]等，也有研究发现污水处理厂污泥中也存在NOx-DAMO微生物[23-24]。

1.3 NOx-DAMO微生物生长代谢影响因素

目前已经研究的影响NOx-DAMO 微生物生长代谢的因素包括环境温度、pH、溶解氧、营养条件、反应器构型、水力停留时间（HRT）、污泥停留时间（SRT）等。普遍认为pH为7.5、温度为35℃是NOx-DAMO 微生物的最适条件[34-35]。NOx-DAMO 微生物严格厌氧，外加体积分数5%的氧气会使NOx-DAMO 古菌M.nitroreducens 中参与甲烷氧化与硝酸盐还原的关键酶功能基因受到抑制[36]。甲烷的低溶解度可能是NOx-DAMO 过程重要的限制因素。实验发现随着甲烷分压从0 增长到49kPa 继而到98kPa，NOx-DAMO 反应器的反硝化速率先快速增加后增速减缓[34]；气体提升方式可在竖直方向上增强混合，提高反应器甲烷的传质效果进而强化NOx-DAMO 过程[37]。矿物元素也对NO-2-DAMO 的反应速率有影响，亚硝氮与甲烷转化速率随Fe2+、Cu2+浓度增加而提高，在20μmol/LFe2+和10μmol/L Cu2+时达到最大，Cu2+浓度过大会抑制微生物活动，而Zn、Mo、Co、Mn、Ni（浓度均低于2μmol/L时）等对微生物生长活动几乎没有影响；在长期培养条件下，Fe2+较Cu2+能更明显提高转化速率，且Fe2+、Cu2+共同作用效果优于两者单独作用[38]。

2 基于NOx-DAMO处理废水的工艺

已经有研究将NOx-DAMO 单独或与其他工艺联合应用于城市污水、污水厌氧消化液和地下水的处理。为了克服序批式活性污泥法（SBR）反应器生物流失问题，具有更好的生物持留能力的MBR、MBfR 和封闭式下向流海绵反应器得到了应用，NOx-DAMO 的脱氮速率得到显著提升。相关工艺研究总结如表2所示。

表1 各类生境硝态氮型厌氧甲烷氧化微生物分布

图2 短程硝化-厌氧氨氧化耦合DAMO反应器生物膜中AOB、厌氧氨氧化菌、DAMO古菌和DAMO细菌生化反应概念图［43］

由于NOx-DAMO 可以耦合硝酸盐/亚硝酸盐还原与甲烷的氧化，故与其他工艺之间的耦合在环境领域也是研究热点。2010年，Zhu等[48]提出了NOx-DAMO与厌氧氨氧化（ANAMMOX）工艺耦合，获得很好的处理效果。Chen等[45]的研究表明，将短程硝化-厌氧氨氧化（nitritation-Anammox）与NOx-DAMO 过程在MBfR 工艺中耦合能去除厌氧消化液中的甲烷，在HRT 为4～8 天、氧气表面负荷为1～2g/(m2d)范围调整时，最大可获得分别为96%和98%的总氮和溶解甲烷去除率。反应器中生物膜的分析表明，氨氧化菌生长于膜上靠近膜一侧，而厌氧氨氧化与NOx-DAMO 微生物共同生长在靠近液相一侧（见图2）。Cai等[46]长期运试ANAMMOXDAMO耦合反应器，发现在运行453天后硝酸盐去除速率可达(684±10)mg/(L·d)（以氮计，下同），已与工程所要求的脱氮速率基本相当。Xie 等[47]利用MBfR耦合ANAMMOX 与NOx-DAMO过程，将HRT从12h 缩短到4h 时，总氮去除速率由90mg/(m3·d)增加到280mg/(m3·d)。物料平衡分析得出厌氧氨氧化产生的硝酸盐有30%～60%被NOx-DAMO 微生物转化为亚硝酸盐，厌氧氨氧化和NOx-DAMO 过程对亚硝酸盐的去除各占90%与10%。在HRT为2天的情况下，耦合工艺脱氮速率高达1kg/(L·d)，不过此过程受亚硝酸盐和氨氮的比例影响较大[39]。日本学者Hatamoto等[42]利用封闭式下流悬挂海绵反应器，在1.25L的柱状反应器内悬挂海绵立方体，得到84.4g/(m3·d)的脱氮速率，甲烷去除效果能达到(3.3±0.9)mmol/(L·d)。

不断有学者为将NOx-DAMO 过程应用于实际废水处理而开展探索。Wang 等[49]提出两种工艺：一种是将NOx-DAMO-ANAMMOX 耦合过程作为侧流工艺，利用厌氧消化产生的甲烷去除厌氧消化液中高浓度（1000～1500mg/L）氨氮，从而提高污水处理厂脱氮效率；另外一种是将NOx-DAMO-ANAMMOX耦合过程用作后处理单元或核心处理单元，利用厌氧消化产生的甲烷去除活性污泥过程出水中的硝酸盐和氨氮，而无需外加电子供体，提高出水质量的同时节省成本。Liu 等[50]提出将活性污泥、部分亚硝化（partial nitritation）、厌氧氨氧化和NOx-DAMO耦合与污泥厌氧消化等连接成整套工艺用于城市废水处理，活性污泥段去除有机物，部分亚硝化与ANAMMOX-DAMO 耦合段用于完全脱氮，从而达到有机物去除、深度脱氮的目的，并估算得到此工艺流程净产生能量274TJ/a（图3）。

UASB 出水含有氨氮和甲烷，厌氧消化液中含有甲烷，Kampman等[43]据此建立了如图4所示的工艺系统，利用亚硝化反应池将废水中的氨氮转化为亚硝态氮回流到NOx-DAMO 反应器中作为甲烷厌氧氧化的电子受体，通过NO-2-DAMO 与亚硝化耦合对UASB 后的低温（10～20℃）出水和厌氧消化液中氨氮与甲烷进行深度处理，最大脱氮速率可以达到33.5～37.8mgNO-3-N/(L·d)。Silva-Teira 等[44]同样利用NOx-DAMO 过程处理UASB 的低温（17～23℃）出水，通过调节回流比得到最大脱氮速率为150mg/(L·d)，甲烷去除速率为180mg/(L·d)，甲烷去除效率高达95%。Luo 等[51]利用MBfR 接种NOx-DAMO微生物处理地下水，获得了45mg/(L·d)的脱氮速率，NOx-DAMO细菌是其主要功能微生物。

表2 当前主要的NOx-DAMO工艺研究汇总

图3 新型城市污水处理系统概念图［50］（处理量5×105m3/d）

图4 UASB协同NOx-DAMO处理低温废水工艺流程图［43］

3 基于NOx-DAMO 处理填埋气和煤层气的探讨

3.1 必要性

温室效应是当前全球面临的重要环境问题，甲烷是重要的温室气体，其温室效应是等摩尔CO2的20～30倍[52]。研究表明，近十年来，甲烷导致温室效应不断增加，特别是从2006 年到2012 年，晴空辐射（clear sky radiation）每年达到(0.026±0.006)(99.7%CI)W/m2[53]。甲烷是能源气体，但许多情况下由于其含量少、难分离等原因并未得到应用，而排放到大气中。例如在垃圾填埋场中，有机物腐化产生的甲烷无组织排放到大气中。中国现有垃圾填埋场1955 个，预计到2030 年会新增495 个，若不采取控制措施，估计到2030年将释放180万吨的甲烷[54]。美国的2450 个垃圾填埋场中1070 个的填埋气平均甲烷含量47.1%[55]。同样，在煤炭开采过程中，出于安全需要对煤层气进行抽采，民用煤层气是CH4体积分数为35%～40%的高浓度煤层气，我国煤层气利用率不足20%，甲烷含量小于30%的煤层气几乎得不到利用，根据利用量估计，每年排空量几百亿立方米[56]，甲烷散逸问题亟待解决。

与此同时，传统废水处理产生大量N2O。N2O也是一种重要的强温室气体，其全球增温潜势为CO2的200～300 倍[57]。王亚宜等[58]根据当前污水处理工艺N2O 排放情况，估算2011 年我国城市污水处理系统N2O释放总量约1.26×109g。根据目前的认识，NOx-DAMO 过程中NO通过歧化反应转化为N2和O2，跃过了N2O产生过程，利用此过程进行废水脱氮，能减少温室气体的排放。

3.2 NOx-DAMO过程应用于填埋气处理

城市生活垃圾具有含水率高、有机物含量高等特点，其中的可降解有机物在填埋场下部的厌氧环境中可转化为甲烷，甲烷不断从底部向上转移，最终释放到空气中。将NOx-DAMO 微生物以生物覆土层的形式引入到垃圾填埋场中，再将渗滤液中氨氮转化为硝态氮回灌到填埋场的方式，可以实现NOx-DAMO 过程的发生，利于填埋场甲烷减排与脱氮。

矿化垃圾中微生物种类丰富，有进行厌氧甲烷氧化的潜力。刘妍妍等[59]的研究结果表明，填埋矿化垃圾中能发生兼/厌氧甲烷氧化反硝化的耦合作用，兼/厌氧条件下，在矿化垃圾中添加能促进CH4的去除；CH4体积分数为40%时，其去除量达到最大值。王旭[60]研究了填埋体中3种类型的甲烷厌氧氧化过程，发现在添加电子受体的填埋体中硝态氮型厌氧甲烷氧化过程（-DAMO）甲烷的降解率比硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化过程（S-DAMO）和铁还原型甲烷厌氧氧化过程（Fe-DAMO）甲烷的降解率高。垃圾渗滤液中有机物和氨氮浓度高，研究表明渗滤液的好氧处理（例如利用MBR工艺）可以去除90%的有机物[61]，可先经好氧过程去除有机物同时将氨氮转化为硝态氮和亚硝态氮，可避免有机物和高浓度氨氮的影响，将矿化垃圾作为填埋覆土层，预处理后的渗滤液回灌到覆土层，NOx-DAMO微生物以此为载体，同时去除填埋体释放的甲烷与渗滤液中氮素。

3.3 NOx-DAMO过程应用于煤层气处理

煤层气开采过程中，由于煤层透气性差、抽采率、抽采浓度低及煤层气利用技术和途径单一等，部分煤层气并没有得到有效利用，透气性差的煤层地面开采相对困难，利用井下瓦斯抽放系统进行开采，一般在含瓦斯不多的煤矿，煤矿矿井中涌出的瓦斯会被通风系统直接排放到大气中，以实现防止爆炸、窒息事故实现安全采煤的目标。毛飞[62]通过注液工艺将32.1t 的好氧甲烷氧化菌培养液泵入煤层中，结果表明甲烷氧化菌能够不同程度地降低两个实验地点的瓦斯动力现象、回风瓦斯浓度、吨煤瓦斯含量、煤层瓦斯压力和钻屑瓦斯解析指标K1值（煤样从煤体中剥落后1min 内的瓦斯解吸量）；其地面试验和井下现场试验表明注入微生物培养液能降低瓦斯压力，证明利用微生物方法处理煤层瓦斯具有可行性。但是，氧气导致的甲烷爆炸风险限制了该技术的应用。当前煤层气开采用增产技术中有水力压裂技术和高压水射流技术等，可在高压水射流技术中引入NOx-DAMO 微生物与基质，通过简单的手段、低廉的成本安全地处理甲烷提高矿井安全系数。根据亨利定律，在标准大气压、27℃条件下甲烷含量为30%的煤层气，通入液相其溶解甲烷浓度约为6mg/L，根据NOx-DAMO微生物反应动力学，NOx-DAMO 微生物的甲烷亲和力常数为1.33～1.92mg/L[63-65]，故在硝酸盐存在条件下，NOx-DAMO微生物可厌氧氧化甲烷将其去除。

4 结语

硝态氮型厌氧甲烷氧化耦合了甲烷氧化和硝态氮还原，且该微生物在各类生境中分布广泛，其应用于环境中甲烷和氮素污染控制具有潜在价值。目前，在MBR、MBfR等反应器中应用NOx-DAMO单独或与其他工艺联合处理模拟废水和实际厌氧消化液的实验取得了明显进展，污染物去除速率和效率显示出了工程应用潜力，为废水生物脱氮碳源不足问题提供了可行的技术途径，同时也一定程度缓解了温室气体排放问题。无规模利用价值的生活垃圾填埋气和煤层气的排放急需低成本和环境友好的解决方案，基于NOx-DAMO 原理开发垃圾渗滤液和填埋气协同处理工艺、煤层气厌氧生物氧化工艺值得探索，如将NOx-DAMO 微生物负载到垃圾填埋覆土中，以减少无法收集利用的甲烷释放；或利用注液技术注入NOx-DAMO 微生物菌液处理煤层瓦斯。NOx-DAMO 微生物较慢的生长速率与反应速率是限制NOx-DAMO 工艺实际应用的关键，如何快速富集NOx-DAMO 微生物仍是今后的一个关键问题。从微生物角度而言，NOx-DAMO 微生物的关键酶NOD 目前尚未获得分离，NOD 的生理生化特性尚不明确。完全解析NOx-DAMO 微生物的生化反应过程，进而为NOx-DAMO 微生物的富集与NOx-DAMO 工艺的调控提供理论基础，最终指导NOx-DAMO 过程的实际工程应用是今后的整体思路与方向。