2017年中国部分地区白斑综合征病毒3个基因的变异分析

刘晓娉，蔡 苗，刘庆慧，万晓媛，黄 倢

( 1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，农业部海水养殖病害防治重点实验室，青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室，山东 青岛 266071； 2.上海海洋大学，上海 201306 )

白斑综合征其病原为白斑综合征病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)，自20世纪90年代暴发于我国后，迅速蔓延至东南亚、南亚、南美洲、北美洲的许多国家[1-2]。白斑综合征病毒的宿主范围十分广泛，苗种的携带是其传播的重要来源，并且具有很高的致病性，感染白斑综合征的病虾死亡率高达100%[3-4]。这种广泛的宿主范围和高致病力被认为是白斑综合征病毒快速和广泛传播的主要原因，给全球范围内的对虾养殖产业带来了巨大的损失。

随着白斑综合征的暴发，国内外学者从病原学、传播途径、流行病学等方面对其展开了广泛的研究[5]。2001年中国、美国科学家完成了其全基因组的测序工作。迄今为止，在GenBank上共有7种白斑综合征病毒分离株的基因组全序列，分别为中国台湾株(TW，AF440570，307 287 bp)、中国株(CN，AF332093，305 107 bp；CN01，KT995472.1，309 286 bp；CN02，KT995470.1，294 261 bp；CN03， KT995471.1，284 148 bp)、韩国株(KR，JX515788，295 884 bp)和泰国株(TH，AF369029，292 967 bp)[6]。核苷酸序列的同一性为99%，其中起源于泰国株的WSSV-TH-96-Ⅱ 具有目前最大的基因组序列，约为312 kb，被假定为祖先株[7]。白斑综合征病毒全序列的公布，对进一步研究其基因的结构和功能起到了指导作用。白斑综合征病毒全基因组中可变位点序列的缺失及变异可能影响其病毒的复制及传播，产生致病力的差异。目前鉴定出5个可变基因座，包括2个具有基因组缺失的区域(ORF23/24和ORF14/15缺失区)和3个具有重复单元变化差异(VNTR)的基因座(ORF75、ORF94和ORF125)[8]，主要应用于白斑综合征病毒分子流行病学的研究。另一方面，对于白斑综合征病毒的衣壳蛋白和囊膜蛋白功能研究也有了一定的了解[9]，如VP26作为白斑综合征病毒粒子的主要结构蛋白，将病毒粒子黏附于宿主细胞，完成进一步的侵染作用[10-11]；VP28的抗血清功能可以中和白斑综合征病毒对虾的感染[12]。而对于病毒不同分离株其他开放阅读框的基因变异研究相对较少。

笔者选取2017年2—6月在中国部分地区采集的44个白斑综合征病毒阳性样本进行白斑综合征病毒DNA聚合酶wsv-pol、wsv313、wsv150这3个未知功能的基因位点DNA以及蛋白质序列的变异情况分析，为进一步研究白斑综合征病毒基因变异位点的功能提供材料。

1 材料与方法

1.1 样本来源

44份凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei) 白斑综合征病毒阳性样本于2017年2—6月分别采自河北、浙江、山东、上海、福建和广东6个不同省市，所有样品采集后当日冷藏运输至实验室于冰箱中-20 ℃冷冻保存。样本采集信息如编号、产地、品种见表1。

表1 凡纳滨对虾样品采集信息

(续表1)

1.2 病毒核酸提取

自保存的样本中约取30 mg鳃组织，按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技有限公司)的说明书进行DNA提取，将提取的DNA样本置于-20 ℃冷冻保存待用。

1.3 PCR检测

对白斑综合征病毒DNA样本采用GB/T 28630.2—2012《白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分套式PCR检测法》为标准进行检测。PCR产物通过用1×TAE电泳缓冲液配制的1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.4 PCR扩增

用Primer 5.0软件设计出序列的特异性引物，然后将白斑综合征病毒阳性样本进行wsv-pol、wsv313、wsv150基因的扩增，通过1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列与反应条件见表2。

表2 PCR扩增的引物及反应条件

PCR扩增体系总量为25 μL，分别为：2.5 μL 10×ExTaq Buffer，2 μL dNTP，1 μL正向引物，1 μL反向引物，0.2 μL ExTaq酶，17.3 μL无菌水，1 μL DNA模板。

1.5 目的基因克隆与序列分析

将PCR产物琼脂凝胶电泳结果中的条带进行回收。纯化的目的基因产物与载体pMD18-T连接，并转化至TOP10感受态细胞中，接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养1 h，涂布于LB(+Amp)固体培养基上。37 ℃过夜培养，每个平板挑取至少5个单菌落接种于LB(+Amp)液体培养基中，37 ℃振荡培养4 h。取1 μL培养物为模板按1.4中的方法进行PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测条带与目的条带一致的菌液全部送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA双向测序。测序结果采用DNAMAN 8软件进行序列比对分析，分别以中国大陆株(WSSV-CN，AF302293.3)序列作为参照，得出核酸水平上的变异情况；用ORF Finder处理测序结果，得到编码的氨基酸序列，用DNAMAN 8软件分析，得出氨基酸水平上的变异情况。

2 结果与分析

2.1 wsv-pol扩增结果

在2017年的44份白斑综合征病毒阳性样本中，wsv-pol的目的条带只在福建霞美镇、广东湛江、山东东营和上海4个地区的样本中出现(图1)，共有12个样本(7、8、9、10、11、13、14、28、29、30、38、43)，检出率为27%，其余32个样本均未扩增出该基因片段。

图1 wsv-pol的PCR扩增电泳结果

2.2 wsv313扩增结果

在wsv313的扩增中，共出现12份阳性样本，分别出现在福建深土镇(6)、福建霞美镇(7、8、9、10、12、13)、广东湛江(28、29、30)、山东滨州(37)和上海(43)，检出率约为27%(图2)。

图2 wsv313的PCR扩增电泳结果

2.3 wsv150扩增结果

在2017年44个阳性样本的wsv150的PCR扩增中，共出现8个阳性样本，分别出现在福建霞美镇(7、9、11、14)、广东湛江(28、29)、山东滨州(37)和山东东营(38) 4个地区，其检出率为18%(图3)。

图3 wsv150的PCR扩增电泳结果

2.4 序列比对

2017年的12个wsv-pol阳性样本中，均在第491～493位缺失GAG 3个核苷酸，由此产生氨基酸水平上的变化是在第164位缺失1个甘氨酸(G)，此外8号样本核酸在37位T变为C，在101位 T 变为C，由此导致氨基酸在13位由酪氨酸(Y)变为组氨酸(H)，在34位亮氨酸(L)变为脯氨酸(P)。10号样本分别在106位赖氨酸(K)变为异亮氨酸(I)，在214位谷氨酰胺(Q)变为精氨酸(R)，在218位赖氨酸(K)变为精氨酸(R)(表3)。

表3 wsv-pol变异情况

在2017年的wsv313的特异性扩增中共出现12个阳性样本，均在27位核酸G替换为A。除29、30号样本外均在822到824位插入核酸TCC，即在280位插入脯氨酸。此外9号样本分别在86位氨基酸天冬酰胺(N)变为丝氨酸(S)，在94位苯丙氨酸(F)变为丝氨酸(S)，在258位精氨酸(R)变为甘氨酸(G)。而29、30号样本，在64位天冬氨酸(D)变为甘氨酸(G)(表4)。

表4 wsv313变异情况

wsv150氨基酸比对结果显示，测序样本均出现不同程度的缺失或突变。主要存在两大类变异情况。一是106个氨基酸大片段缺失，发生在第200个氨基酸之后(图4)，分别出现在福建霞美镇(7、9、11、14)、广东湛江(28、29)、山东滨州(37)、山东东营(38)的样本中。二是发生4个氨基酸的变异也均出现在8个阳性样本中，即第196位丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)，第197位亮氨酸(L)突变为丙氨酸(A)，第198位谷氨酰胺(Q)突变为脯氨酸(P)，第199位苯丙氨酸(F)变为缬氨酸(V)(表5)。

图4 wsv150 氨基酸片段缺失示意

表5 wsv150变异情况

3 讨 论

3.1 白斑综合征病毒的基因组研究

白斑综合征病毒是环状双链DNA病毒，基因组大小约300 kb，是目前已测序的最大动物病毒之一。白斑综合征病毒由于地理范围和宿主类别等环境的不同，导致不同毒株基因存在差异，这种差异往往通过研究ORF14/15和ORF23/24的缺失，ORF75、ORF94和ORF125的重复单元数目以及SNP来获得。已有的研究表明，对虾鳃组织是白斑综合征病毒主要靶组织，因此试验中取鳃组织进行病毒检测[13]。近年的研究表明，除白斑综合征病毒可变区外，不同分离株中个别ORF也存在明显的变异。Li等[14]分析了不同毒力3株白斑综合征病毒全基因组序列发现WSSV-CN01，WSSV-CN02，WSSV-CN03 与WSSV-CN相比具97.32%、97.23%、91.65%的同源性，但也存在一些差异。据报道[15]，wsv001在中国不同地区的白斑综合征病毒分离株中存在明显变异。

3.2 白斑综合征病毒可变位点的变异分析

DNA聚合酶是参与DNA复制的重要酶类，同时DNA聚合酶基因也是白斑综合征病毒复制过程中关键作用酶基因的组成部分，属于白斑综合征病毒的致病因子之一[5]。完整的病毒DNA聚合酶序列全长6585 bp，编码2195个氨基酸(wsv-pol)。本研究中，wsv-pol是一段高度保守的序列，扩增片段氨基酸位于500～950位，其扩增片段中包含DNA聚合酶的功能区。在2017年样本的扩增中，wsv-pol的目的条带只在福建霞美镇、广东湛江、山东东营和上海4个地区的样本中出现，共有12个阳性样本，检出率为27%。比对结果显示，12个阳性样本均在第491～493位缺失GAG 3个核苷酸，由此产生的氨基酸水平上的变化是在第164位缺失1个甘氨酸。该甘氨酸的缺失对白斑综合征病毒 DNA聚合酶功能的影响尚需进一步研究。除此之外福建霞美镇的8、10号样品存在不同的个别氨基酸替换现象，表现出了同一地区的差异性。研究结果显示，wsv-pol未表现出较大程度的变异，但变异情况较为复杂，分别表现出了地区的差异性和一致性。

wsv313全长3543 bp，编码1180个氨基酸，其195～483位氨基酸是微管结合蛋白MIP-T3的功能区。本研究侧重分析wsv313编码氨基酸功能区(195～483位氨基酸)即微管结合蛋白功能的变异情况。在福建深土镇及霞美镇、广东湛江、山东东营和上海4个地区也出现12个wsv313阳性样本，检出率为27%。对12个样品进行测序分析表明，wsv313均在27位核酸G替换为A，除去29、30、43号样品外均在822到824位插入核酸TCC，即在280位插入脯氨酸。脯氨酸是一种环状的亚氨基酸，为海洋浮游生物中一种含量居中的氨基酸，一旦进入肽链后，可发生羟基化作用，从而形成4-羟脯氨酸，是组成动物胶原蛋白的重要成分。有研究表明，脯氨酸可以维持膜结构稳定，清除活性氧，其累积量与植物的抗逆性呈正相关[16-17]。此外，蔡苗等[18]在对白斑综合征病毒变异情况分析的研究中发现，wsv006位点氨基酸的主要变异情况也是脯氨酸的插入。推测白斑综合征病毒脯氨酸的插入是为了增强自身对环境的适应性而发生的选择性变异，上述变异是否造成微管结合蛋白功能的改变还有待进一步研究。

wsv150含305个氨基酸，比对结果显示，测序样品均出现不同程度的缺失或突变，主要发生在福建霞美镇、广东湛江、山东滨州、山东东营4个地区，检出率约为18%。研究结果显示，不同地区样本变异情况存在一致性，在8个阳性样品中均出现大片段缺失及196～199位氨基酸的突变。其大片段的氨基酸缺失可能导致蛋白质的分子构型发生变化，功能部分或者完全丧失。

综上所述，本试验结果表明，wsv-pol和wsv313的核酸序列保守性较高，核苷酸序列的变化引起氨基酸变化未出现较大程度的变异，各分离株间的差异也极小，而wsv150的变异程度较大，表现出地区之间高度一致性。白斑综合征病毒不同分离株基因变异而致氨基酸变异，这些缺失和变异对致病力的影响还有待于进一步的研究。