沼液回流提升推流式厌氧反应器运行效果研究

董丽丽， 曹广丽， 武继文， 任南琪

(哈尔滨工业大学 环境学院 城市水资源与水环境国家重点实验室， 哈尔滨 150090)

近年来，随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的提高，我国畜禽养殖业迅猛发展。同时畜禽养殖业的规模不断扩大，集约化程度逐年增高，随之而来产生了越来越多的有机固体废弃物和高浓度有机废水，给环境带来了严重污染和压力。据统计，2015年，我国全年禽畜排放粪便量(包括尿液量)达到65.54亿t，其中牛粪 20.94亿t[1]。预计到2020年我国畜禽粪污每年总排放量会超过40 亿t[2-3]。畜禽粪污虽然是农业环境的主要污染源，但也是蕴含巨大能量的可再生能源，若能进行合理开发利用，可以创造巨大的经济效益和环境效益[4]。厌氧消化是畜禽粪污无害化和资源化处理应用的最有效方式之一[5-6]。

沼气工程生产大量甲烷的同时还产生了大量的沼液。沼液作为沼气工程中的一种有价值的副产物，其含有多种生物活性物质，如氨基酸、维生素、微量元素等，可防治害虫，提高抗病能力[7-8]。此外，沼液作为一种优质的基础肥料，可以肥沃土壤，改良作物品种，提高产量。但由于很多大型沼气工程周边土地配套不足、同时农田分散、季节性耕种等原因，沼液还无法充分实现全量利用[9]。这就造成了造成了严重的资源浪费和对环境的二次污染，不利于沼气工程的建设和推广。近年来，开始有人研究将厌氧消化的沼液再回流到厌氧系统中，这样不仅能够提升进料中的微生物含量，使底物得到更充分利用，又可减少沼液后续处理的负担，从而保证了大中型沼气工程的顺利运行和可持续发展[10-11]。同时沼液回流技术为大中型沼气工程运行过程中的减排和节约淡水资源提供重要的理论和现实意义。吴树彪[12]在研究沼液回流对牛粪厌氧发酵产气特性能影响时得出的50%的沼液进行回流时，能够提高基质产甲烷率，促进厌氧发酵系统中微生物的合成代谢。Guo[13]等研究结果指出餐厨垃圾和猪粪在中温条件下进行发酵产甲烷，回流能够增加基质的产甲烷率。王星[14]研究结果发现，在低负荷条件下，提高消化液回流比可以使餐厨垃厌氧发酵系统的产气量明显提高。完全混合式反应器(Completely-stirred tank reactor, CSTR)和推流式反应器(Plug-flow reactor, PFR)是厌氧发酵产沼气工艺中最常见的两种反应器[6]。相较于CSTR容易出现底物短流的现象，理想的PFR反应器不将底物与所有污泥完全混合，而是与部分污泥混合后从反应器的进料端进入反应器，使其在反应器长度方向呈活塞方式依次向前推进，直至反应器的出料端出料，从而能够避免短流现象，尤其是在处理高含固率有机物(如畜禽粪便、农作物秸秆)的发酵处理时，减小了动力消耗，降低了运行成本[15-16]。然而，对于沼液回流技术应用在PFR厌氧发酵牛粪产沼气方面缺乏相应研究。

本文以牛粪为原料，在45 L半连续进料PFR的厌氧反应器中，设置未回流沼液和使用了回流进料量50%的沼液的进料方式，考察长期消化过程中沼液回流对产甲烷效率和稳定性参数的影响。在100 d的连续运行中监测每日的产气量、气体成分组成、进出料pH值、进出料的总干物质含量(TS)和挥发性有机物含量(VS)、以及每隔3至7 d对反应器进行取样监测pH值的变化。同时结合高通量测序给出沼液回流后反应器处于稳定运行期内的微生物群落状态。这为以牛粪为原料在PFR内提升厌氧发酵效率提供了基础的数据，同时对大型沼气工程运行降低成本、减少沼液后续处理及利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 牛粪及接种物

实验中所用的牛粪取自哈尔滨完达山奶牛养殖有限公司(5000头规模奶牛场)的泌乳牛舍。新鲜的牛粪收集到密闭的容器中，放置在4 ℃的冰箱中储存。为了防止牛粪长时间存放导致营养物质的消耗，实验所用牛粪每7天重新取一次。反应器启动过程中所用接种沼液取自现代牧业双城粪污处理项目，该项目采用的是PFR厌氧发酵工艺，装机容量为3MW[6]。该项目自建设投产使用至今已经连续稳定运行5年，日产沼气3.97万立方米。牛粪和接种沼液的主要理化指标如表1所示。

表1 牛粪及接种沼液的特性( 质量分数)

1.2 实验装置和运行

实验采用1个体积为45 L的PFR反应器(见图 1)进行半连续进料厌氧发酵，有效发酵体积为36 L，水力停留时间(HRT)为20 d。在沼液回流运行期，每天回流进料量50%的沼液到进料底物。

图1 推流式(PFR)厌氧发酵实验装置流程图

实验具体过程如下:在38 ℃±1 ℃发酵温度下，反应器中接种36 L沼液开始启动，启动期间为了保证反应器内微生物尽快适应新环境，采用逐渐增加进料量的进料方式，每天定时用蒸馏水将牛粪稀释到TS浓度为7%～10%，配好的料液加热至38 ℃±1 ℃后混匀进入反应器。当沼气日产量、甲烷体积分数稳定后逐步提升进料量直至设计负荷(反应器启动的第1 天到18 天)，反应器开始进入运行阶段(第19天到46 天)，反应器从第47 天开始回流沼液，具体步骤为:利用反应器每日出料的沼液与进料底物以 1∶2体积比混合均匀进入反应器，实验继续运行至第100 天结束。

1.3 检测方法

为了检测反应器启动及运行过程的各项参数，进出料的样品每天收集，取样孔1，取样孔2每隔5～7 d取样一次。使用排水法记录日产气量。利用气相色谱仪测定气体组分和挥发酸(VFAs)(GC, 7890A, Agilent Cooperation, USA)；总固体含量(TS)与挥发性固体含量(VS)采用重量法测定；pH和化学需氧量(COD )用HACH-HQ40d multi和HACH-DRB 200测定。总氮(TN)和总磷(TP)用analytikjena multi N/C 2100s和Perkin Elmer Optima 8300测定。氧化还原电位用上海精密仪器公司生产的C220-ORP测定仪测定。

1.4 微生物Illumina MiSeq高通量测序

为了观察回流沼液后反应器内微生物群落的状态，在反应器回流沼液运行稳定后分别从取样孔1、取样孔2取3～10 mL样品于离心管中放置在-80 ℃的冰箱中作为DNA分析的样品。

根据E.Z.N.A.®soil试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；细菌扩增引物为338F (5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)对V3-V4可变区进行PCR扩增。古菌的扩增引物为524F (5' - TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3')对V4-V5可变区进行PCR扩增。扩增体系为20uL，4uL 5*FastPfu缓冲液，2uL 2.5mM dNTPs，0.8uL引物(5uM)，0.4ulFastPfu聚合酶；10ng DNA模板。扩增程序为：95℃预变性3min，27个循环(95℃ 变性30s，55℃ 退火30s, 72℃ 延伸30s)，最后72℃延伸10min (PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型)。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。纯化后再送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。采用 Qiime软件(version 1.17)和UCHIME对原始数据进行过滤、修剪并嵌合体序列。采用Uparse(version 7.1)进行运算分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类分析(97%相似度)，并通过RDP Classifier(version 2.2)对OTU的代表序列作分类学分析(70%的相关系数阈值)。基于 OTU 聚类分析结果，采用Mothur软件(Mothur v.1.30.1)对 OTU 进行多样性指数分析[15]。

2 结果与讨论

2.1 沼液回流对日产气量及气体成份变化的影响

快速稳定的启动对于一个厌氧反应器十分必要。为了缩短反应器启动期的时间，在启动阶段(第1 ～18 天)采用100%的体积比沼液接种，同时根据日产气量的情况逐渐增加进料量来保证快速稳定的启动。如图2所示，反应器运行的前5天，产气量一直处于较大的波动状态，造成这样现象的原因主要是接种物刚进入一个新环境，它有一个适应期和延滞期。有研究结果表明，产甲烷菌的水力停留时间要超过5 d之后才能够开始利用挥发酸等营养物质生产甲烷[18]。反应器从第6 天开始，日产气量开始逐渐上升，直至第18 天达到38.19 L·d-1，容积产气率达到了1.06 L·L-1d-1。从第19 天 到 46 天的运行，反应器的容积产气率变化不大，在一定范围内进行波动，这表明反应器在第18 天时启动成功，内部的厌氧微生物已经适应新的环境。

图2 日产气量变化曲线及每日沼液回流量

反应器在成功启动后，进入稳定运行期(第19 d～46天)，即每日不回流沼液到进料中。如图2所示，反应器在稳定运行期内，日产气量在35.93 L·d-1～45.96 L·d-1之间波动，平均日产气量为40.79 L·d-1，但整体保持平稳状态。造成每日产气量波动的原因主要是因为每日进料底物中营养物质一直处于一个波动的状态，造成产气量产生波动。反应器从第47天开始，进料底物中每日回流进料量一半的沼液，从图2中可以看出从回流沼液开始，日产气量逐渐上升，直至第52 天，日产气量达到峰值57.92 L·d-1(容积产气率为1.61 L·L-1d-1)。从第53 天开始至运行结束，日产气量在48.45 L·d-1～57.92 L·d-1之间波动，日均产气量为52.52 L·d-1。相较于未回流沼液运行阶段，日产气量提升了28.76%。由此表明沼液回流能够提高反应器整体的产气量。在厌氧发酵过程中，底物的水解程度关系到整个发酵过程的效率，沼液回流能够提升PFR厌氧反应器前端的微生物浓度，强化牛粪水解酸化效果进而提高沼气产量。这与王文政[19]和卢艳娟[20]在研究沼液回流对玉米秸秆厌氧发酵产气性能影响和沼液回流对厌氧沼气工程的影响时得出的回流对日产气量无明显作用的结果不太相同。

沼气当中主要含有甲烷和二氧化碳。甲烷体积分数是衡量厌氧消化系统运行效率的基础指标[12]。在反应器启动的前5 d，甲烷的含量低于50%且波动较大(见图3)。这是由于反应器启动时气室中充满的是空气，这些空气会逐步随着产生的沼气排出，同时由于微生物处于适应期，消耗的营养物质主要用于自身繁殖，因此沼气中甲烷含量较低，而二氧化碳的含量较高。从第6 天开始，甲烷含量开始升高，到第11天时，甲烷含量达到60.75%。在反应器之后的运行直至停止运行，甲烷含量在58.32%～65.85%波动，日产平均甲烷含量为61.16%。而在沼液回流运行期间，每日产气中的平均甲烷含量为61.15%。由此表明，沼液回流对产生的沼气中甲烷含量并未有所影响。

图3 日产沼气中气体成分变化情况

2.2 进料出料及取样的pH值变化

在厌氧消化过程中，pH值是影响微生物生长的重要参数[21]。根据文献报道，甲烷菌对 pH值较为敏感，其适宜生长的pH值范围为 6.5～7.8之间[22-23]。如图4所示，反应器每日进料的pH值在6.30～7.93波动，且波动较大。这主要是牛粪的pH值是波动的，造成每日进料的pH值变化。然而在沼液回流运行期间，进料的pH值在6.30～6.98波动。波动的范围明显缩小，这表明沼液回流可以对进料的pH值起到缓冲作用。进料的pH值变化变小，对反应器的稳定运行极为有利。然而从出料的pH值可以看出，启动期间出料的pH值在7.28～7.96波动，且在启动后5 d，pH值逐渐趋于稳定。这表明反应器在启动阶段，微生物从进入到新环境到逐渐适应的过程。从图4中可以得出，运行阶段出料的pH值波动很小，一直处于7.73～7.86波动。然而在第36 天出料的pH值为7.22，产生这种现象主要是由于PFR反应器的结构特点，PFR的进料是先进先出，造成这一天pH值较大幅度降低是由于一个停留期前当天进料的pH值较低。底物经过一个水力停留期发酵，尽管产甲烷的过程中pH值升高，但是由于水解酸化后的pH值较低，以至于出料的pH值也低。但该数值也在甲烷发酵的正常范围内。在沼液回流运行期，反应器的出料pH值一直处于较小幅度的波动，在7.18～7.34之间，这验证了沼液回流能够缓冲进料的pH值，进而影响出料的pH值浮动。同时也反映了反应器的稳定运行状态。从对反应器运行过程中取样的数值可以看出，在启动期和运行期的波动幅度较大，而沼液回流运行期，pH值的波动幅度较小。这说明沼液回流能够起到缓冲运行过程中的pH值。

图4 每日进出料及取样的pH值变化情况

2.3 原料产气率

反应器整个运行期内干物质的产气率和挥发性有机物的产气率及产沼率如图5和图6所示。在启动期内，挥发性有机物的产气率在8.22 L·kg-1VS (7.06 L·g-1TS)～346.20 L·kg-1VS (294.29 L·kg-1TS)波动较大。主要是由于启动期间原料的水力停留时间是从开始的1天增长到设计的20天，原料产气率逐步提高；其次是在启动期间微生物在进入新环境中还不稳定。因此启动期原料产气率波动较大，并随着启动期的进行产气率逐渐提高并稳定。当反应器进入运行期，挥发性有机物的产气率整体处于稳定状态，在平均值321.14 L·g-1VS (257.60 L·kg-1TS)上下波动。平均挥发性有机物的产甲烷率为196.52 L·kg-1VS (157.70 L·kg-1TS)。在反应器沼液回流运行期内，挥发性有机物的产气率在小幅度波动的下整体呈上升趋势，在反应器运行到第96天 时，挥发性有机物的产气率达到最大值502.78 L·kg-1VS (411.95 L·kg-1TS)。整个沼液回流运行期内，平均挥发性有机物的产气率为433.03 L·kg-1VS (366.99 L·kg-1TS)，平均挥发性有机物的产甲烷率为265.18 L·kg-1VS (224.66 L·kg-1TS)，相比未回流沼液的运行期的平均产气率提升42.46%。这些结果说明，沼液回流能够有效提升反应器内底物的整体产气效率。

图6 每日原料产沼率变化曲线

图5 每日原料产气率变化曲线

2.4 原料降解率

图7和图8显示的是牛粪厌氧消化过程总固体质量和挥发性有机固体去除效率的变化情况。启动期内，反应器的出料是启动时加入的沼液，这个时期的原料降解率在图7～图8中不能真实反应底物的降解效率。这是由于物料的先进先出，只有在经过一个水力停留期之后，反应器的出料才能反映底物的降解程度。随着反应器的启动成功，运行期内，总固体质量的去除率呈大幅度波动且有下降趋势，在12.45%～51.65%波动。平均每日的总固体质量的去除率仅为31.15%。然而在进料中回流了沼液之后的运行期，总固体质量的去除率呈小幅的波动，但总体呈逐渐上升趋势。总固体质量的去除率在33.24%～56.76%波动，平均每日的总固体质量的去除率为47.25%。而且在反应器运行到第76 天，总固体质量的去除率达到最大值56.76%。相较于未回流沼液的运行期，在沼液回流后平均的总固体质量的去除率提升16.1%。挥发性有机固体去除效率呈现相同的规律，在无回流运行期平均去除率为31.15%。而在沼液回流运行期，平均去除率开始提升至48.99%。相较于未回流沼液的运行期，挥发性有机固体去除效率提高17.84%。这些结果进一步说明，沼液回流能够提升底物的降解效率。Chen et al.研究沼液回流对牛粪厌氧发酵的影响也得到了沼液回流能够增加原料利用率，提高厌氧发酵效率，增强系统运行稳定性的结论[24]。

图7 每日进出料总干物质质量及去除率

图8 每日进出料总挥发有机物质量及去除率

2.5 沼液回流运行期的微生物群落状态

2.5.1 微生物多样性

对Miseq测序所得不同取样位置样品的微生物16S rRNA基因进行统计分析，结果汇总见表 2。从表2可以看出每个样品良好的文库覆盖度表明所测序列量已经基本上可以完整反应该样品实际序列信息。表征丰富度的ACE指数和 Chao1指数结果显示反应器后部的细菌丰富度要稍高于前部的，而古菌丰富度前部要高于后部的。表征多样性的Shannon和Simpson指数结果显示，反应器后部的细菌的多样性要高于反应器前部的，而古菌的多样性则前后几乎一样。

表2 沼液回流运行期应器不同取样位置样品中微生物序列的统计分析结果

2.5.2 发酵料液中细菌群落组成分析

将细菌的各菌群丰度占比1%以上的9类菌门作图(见图9，图10)，从门的分类水平进行分析，反应器中无论前段还是后段拟杆菌门厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)占比最高，总比例超过了75%。同时还有较小比例的互养菌门(Synergistetes)，绿弯菌门(Chloroflexi)，Parcubacteria门，变形菌门(Proteobacteria)以及疣微菌门(Verrucomicrobia)。同时在反应器的后部还富集了1.12%的螺旋体菌门(Spirochaetes)。这些细菌门均是牛粪厌氧消化体系中常见的优势细菌门[6,25]。主要负责牛粪的水解酸化等过程。Li[26]等研究结果显示厚壁菌门和拟杆菌门是粪便和秸秆共消化过程主要的水解酸化菌。Paredes-Sabja[27]等报道厚壁菌门对纤维类物质的底物有较强的降解能力。另外，李海红[28]在研究中发现拟杆菌门有降解大分子碳水化合物产酸的功能。这些结果都表明，在本研究中的，经过沼液回流后的反应器中富集了大量的降解牛粪中纤维类物质的功能菌群，致使获得较高的底物转化效率。

图9 反应器在沼液回流运行期取样孔1样品细菌在纲水平的分类组成

图10 反应器在沼液回流运行期取样孔2样品细菌在纲水平的分类组成

图11显示了细菌在属水平的组成。在反应器的前段和后段中，主要以厚壁菌门的梭状芽胞杆菌属(Clostridium)为主。研究发现梭状芽胞杆菌能够产生蛋白酶、纤维素酶等有机物降解的酶类，它同底物转化成挥发酸密切相关。同时梭菌除水解酸化外，还涉及产氢产乙酸和乙酸氧化过程[29]。Weimer[30]等发现Clostridium能够将纤维素和半纤维素等大分子水解成葡萄糖。另外在反应器前后段还含有丰度相当的Sedimentibacter属,Proteiniphilum属,Cloacibacillus属,Parcubacteria_genera_incertae_sedis属,Petrimonas属,Ornatilinea属,Syntrophomonas属和Pelotomaculum属。同时反应器前段相比于反应器后段还有一定量的Macellibacteroides属,Aminivibrio属和Phascolarctobacterium属。这些细菌同样在参与底物从大分子降解成小分子过程中起到重要的作用。例如，有文献报道Sedimentibacter属在物质从产氢到转化为甲烷的过程中起到连接的作用[31]。对于牛粪这种富含大量纤维类物质的底物降解是一个复杂的代谢过程，需要多种功能微生物共同参与。而本文的研究结果显示，回流沼液后的PFR厌氧反应器中富集了优势的降解牛粪原料为底物的功能微生物，同时又存在着多种的其他水解酸化微生物进行协同作用共同完成底物的有效降解，继而获得较高的产甲烷率。

图11 反应器在沼液回流运行期取样孔1，取样孔2样品细菌在属水平的分类组成

2.5.3 发酵料液中古菌群落组成分析

古菌的各菌群丰度在门的分类水平上分析(见图12，图13)，产甲烷作用由一类特殊的微生物—产甲烷菌利用产氢产乙酸阶段的产物如乙酸，H2/CO2，以及甲酸、甲醇和甲胺类等简单的有机化合物进行产甲烷的过程[12]。在反应器的前段中广古菌门(Euryarchaeota)是绝对优势菌门，相对丰度为 75.32%。随着底物从前向后推进，反应器的后段仍以广古菌门为绝对优势菌种，相对丰度为68.41%。而在反应器的前端泉古菌门(Crenarchaeota)仅有14.16%的丰度，而在反应器的后段，泉古菌门得到了富集，相对丰度为26.65%。广古菌门内的成员被发现是普遍存在多种厌氧反应器中主要的产甲烷菌。而泉古菌门的成员在产甲烷过程中也起到重要的作用。

图12 反应器在沼液回流运行期取样孔1样品古菌在纲水平的分类组成

图13 反应器在沼液回流运行期取样孔2样品古菌在纲水平的分类组成

从图14古菌属的分类组成可以得出，在反应器的前段和后段的主要产甲烷菌属为甲烷丝菌属(Methanothrix)和甲烷螺菌属(Methanospirillum)以及少量的甲烷杆菌属(Methanobacterium),甲烷八叠球菌(Methanosarcina)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)。其中甲烷丝菌属和甲烷螺菌属的相对丰度含量超过了60%。而且在反应器的前部甲烷丝菌属的相对丰度要高于反应器的后段。甲烷丝菌属在前部的丰度为40.62%，相较于后部高1.23%。有文献报道，甲烷丝菌是目前已知的仅有的两种仅以乙酸盐为能量来源、通过厌氧代谢生成甲烷而不利用氢气和二氧化碳的产甲烷菌之一[32]。这主要是因为PFR的前端是底物的大量水解酸化的过程，生成大量的乙酸，因此会促使乙酸型产甲烷的富集。在底物大量水解为乙酸的同时，伴随着氢气的生成，因此促使了甲烷螺菌这种氢营养型甲烷菌在系统内的富集，它是主要的利用H2和CO2产生甲烷菌属。然而随着底物逐步推向出料端，可水解的物质多为难降解的大分子物质，因此水解过程逐渐变弱，同时水解的产物也复杂多样，因此甲烷菌群在以甲烷丝菌为绝对优势菌群外，另外混合营养型的甲烷八叠球菌、以及一些未分类的甲烷菌的丰度在升高，它们同样在甲烷生成的过程中起到了关键作用。在专性产甲烷菌处于绝对主导地位的同时，含有兼性产甲烷菌，在这些产甲烷菌以及水解菌的共同作用下，使得反应器高效稳定的运行。

图14 反应器在沼液回流运行期取样孔1，取样孔2样品古菌在属水平的分类组成

3 结论

本研究利用牛粪作为发酵底物，考察了在PFR反应器厌氧消化的过程中回流50%的沼液对反应器的性能及底物转化效率的影响。在沼液回流后，反应器的日产气量最高达到57.92 L·d-1，容积产气率达到1.61 L·L-1d-1。平均日均产气量为52.52 L·d-1，平均挥发性有机物的产气率为433.03 L·kg-1VS (366.99 L·kg-1TS)，相比于未回流沼液的运行期的平均干物质产气率提升42.46%，且平均甲烷含量为61.20%。同时在沼液回流运行期，底物降解率达到48.99%。通过对微生物群落的分析，细菌主要以厚壁菌门的梭状芽胞杆菌属和拟杆菌门的功能菌为主。古菌群落则以甲烷丝菌属和甲烷螺菌属为绝对优势菌属。可见，沼液回流能够显著提升牛粪在PFR厌氧消化性能。另外沼液回流还能减少后续沼液处理量。这一结论为沼气工程长期稳定的运行提供理论参考。