副鸡禽杆菌外膜囊泡的生物学活性分析

梅 晨 ， 孙爱华 ， 李淑芳 ， 龚玉梅 ， 王宏俊

(北京市农林科学院畜牧兽医研究所 畜禽疫病防控技术北京市重点实验室 ， 北京 海淀 100097)

副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum, Apg)是鸡传染性鼻炎(IC)的病原[1]，为革兰阴性菌，主要引起育成鸡生长停滞及蛋鸡产蛋率下降[2]，给养鸡业造成了重大经济损失[3]。目前控制鸡传染性鼻炎的方法主要是采用全菌灭活疫苗[4-6]配合抗生素治疗或预防的综合措施。

外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMVs)是细菌特有的一种生理结构，革兰阴性菌及少量革兰阳性菌都可以产生OMVs[7]。OMVs是一种双层膜球状囊泡状结构，其大小在20～250 nm[8]。OMVs在细菌的生长、生存、毒力等生理活动中扮演重要角色，由于OMVs不能复制且含有脂多糖、外膜蛋白、磷脂及少量DNA等成分，能有效激活免疫系统，被认为是极具潜力的新型疫苗之一[8]，但其作用机制尚不明确。本试验拟探讨副鸡禽杆菌外膜囊泡的相关生物活性，为鸡传染性鼻炎新型疫苗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 副鸡禽杆菌A型hp8株, B型BJ株和C型668株由本实验室保存。

1.2 囊泡的提取及纯化 常规兼性厌氧条件下培养hp8株副鸡禽杆菌，挑取单菌落于TSB培养基中，37 ℃温箱震荡厌氧培养12 h，按1∶50转接，37 ℃温箱震荡厌氧培养4～6 h，4 ℃，8 000 r/min离心10 min。取上清，0.45 μmol/L滤膜过滤，4 ℃，35 000 r/min超速离心3 h，弃上清。用2 mL 20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液 (pH值7.5)重悬沉淀，存放于-20 ℃。即为粗提的外膜囊泡。

用HEPES溶液将Optiprep配置成不同梯度浓度(60%、40%、35%、30%、25%、20%)，取上述粗提外膜囊泡与60%的Optiprep溶液按1∶3体积比稀释至45%，吸取2 mL置于离心管底部，再依次加入上述40%及更低浓度的Optiprep溶液各 2 mL。4 ℃,35 000 r/min离心3 h。离心后吸取肉眼可见的黄色层，即为目标囊泡所在溶液。……