传统腌渍蔬菜中抑制嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成乳酸菌的筛选

孙梦桐 吕欣然 林 洋 崔天琦 白凤翎 励建荣

（渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州121013）

嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体环境中，是多种水生动物的原发性致病菌和条件致病菌，也可导致典型的人-兽-鱼共患病。对水产养殖业而言，嗜水气单胞菌感染的主要鱼类包括鲈鱼、鲤鱼、鲶鱼和罗非鱼等主要经济鱼类品种[1]。目前，这类鱼病的防治策略主要采用抗生素等药物，而频繁使用抗生素的危害是使细菌产生耐药性，耐药菌的繁殖会使抗生素的用量不断增加，如此形成恶性循环，致使药物在鱼体内大量残留，导致养殖水体环境污染严重[2]。

大量研究表明，嗜水气单胞菌具有AhyI/R 群体感应（Quorum sensing，QS）信号传导途径，利用N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs） 信号分子如N-丁酰-L-高丝氨酸内酯（C4-HSL）和N-3-己酰-DL-高丝氨酸内酯（C6-HSL）作为信号分子，AHLs 与嗜水气单胞菌生物膜和多种毒力因子密切相关[3-5]。采取干扰、破坏和阻断细菌群体感应手段，使其生物膜和毒力因子形成受阻，是控制由嗜水气单胞菌引起水产养殖疾病的一条新途径。

从自然生态环境中分离筛选对群体感应具有抑制作用的活性物质即群体感应抑制剂（Quorum sensing inhibitor，QSI） 是当前该领域研究的热点之一。革兰氏阴性菌QSI 主要来源于植物、动物和微生物[6-8]。Mohabi 等[9]研究发现白栎提取物（Quercus infectoria galls extract，QIFGE） 对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群体感应具有抑制活性，使其不能形成毒力因子，从而达到控制铜绿假单胞菌感染的作用。微生物源性QSI 一般来源于真菌和细菌。Chang 等[10]从北大西洋浮游微生物根瘤菌（Rhizobium sp.）中分离培养和筛选对铜绿假单胞菌PAO1 具有抑制活性的QSI，获得的次级代谢产物N-丁酰高丝氨酸内酯（C4-AHL）类似物具有破坏铜绿假单胞菌生物膜结构的能力，且可以通过降低AHLs 介导的毒力因子，如弹性蛋白酶活性和铁载体的产生来控制铜绿假单胞菌PAO1 毒力因子的致病作用。

乳酸菌通过产生细菌素、有机酸、罗伊菌素等代谢产物以及生态位和营养物竞争方式抑制其它种微生物的生长繁殖[11-13]。乳酸菌生物制剂已广泛应用于乳制品、肉制品、水产品及果蔬制品等的防腐保鲜[14-16]。目前，有关细菌源性QSI 的国内外研究相对较少，以乳酸菌为革兰氏阴性菌QSI 的研究鲜见报道。Park 等[17]研究发现，从泡菜中筛选的菌株清酒乳杆菌 （Lactobacillus sakei）NR28 通过对大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC43894 的AI-2受体淬灭的方式来抑制群体感应，达到降低其致病性的目的。Sha 等[18]在虾饵料中同时添加戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）HC-2 和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）E1，结果表明戊糖乳杆菌HC-2 中luxS 基因的过多表达限制了副溶血弧菌E1 接近组织受体或影响其群体感应基因的转录来抑制的群体感应和毒力相关基因的表达。本文从传统腌渍蔬菜中筛选对嗜水气单胞菌群体感应具有抑制作用的乳酸菌，并研究其作用机理，为研发一种新型、安全、高效的水产养殖微生态制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株 目标菌株：乳酸菌菌株及来源，见表1。

表1 传统腌渍蔬菜分离的乳酸菌菌株及来源Table 1 Sources of LAB isolated from traditional pickled vegetables

指示菌株：紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026；受试菌株：嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）LY-2，分离自辽宁绥中养殖大菱鲆体表。以上菌株由本微生物学与分子生物学实验室保藏。

1.1.2 培养基和试剂 LB 培养基、MRS 培养基，北京奥博星生物技术有限公司；碱性蛋白酶（200 000 μ/g）、木瓜蛋白酶（200 000 μ/g）、胃蛋白酶（15 000 μ/g）、胰蛋白酶（250 000 μ/g）、中性蛋白酶（200 000 μ/g），华蓝化学有限公司；卡那霉素、细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；乳酸菌生化鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DL-CJ-2N 超级洁净工作台，北京市东联哈尔仪器制造有限公司；IKA Vortex GENIUS 3 振荡器，德国IKA 公司；SPX-25 生化培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；MS105UD 电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；5804R 高速冷冻离心机、ABI stepone plus PCR 仪，德国Eppendorf 公司；DYY-8C 电泳仪，北京市六一仪器厂；Quantity One 凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；GI54DS立式高压蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Imark 酶标仪，美国BIO-RAD；Labconco Free Zone 2.5 台式真空冷冻干燥机，美国LABCONCO 公司；S-4800 扫描电镜、E-1045 镀金仪，日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌无细胞上清液 （Cell free supernatants，CFS） 和嗜水气单胞菌AHLs 粗提物的制备 将乳酸菌菌株接种于MRS 液体培养基37 ℃培养24 h，传代2 次。以2.0%接种于MRS 液体培养基37 ℃培养12 h 后，在4 ℃下6 500 r/min 离心15 min，用0.45 μm 滤膜过滤获得CFS，4 ℃冰箱保存备用。

参考Vattem 等[19]的方法，将-80 ℃保藏的嗜水气单胞菌LY-2 接种于LB 肉汤中，30 ℃恒温培养24 h，传代2 次后以1.0%接种量30 ℃培养12 h，在4 ℃下6 500 r/min 离心15 min，得上清液。将上清液与乙酸乙酯等体积混合振荡，静置15 min待分层，取乳化层，重复2 次。50 ℃120 r/min 旋转蒸发至乙酸乙酯完全蒸干。用甲醇溶解AHLs粗提物，-18 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 抑制嗜水气单胞菌群体感应乳酸菌的筛选

将紫色杆菌CV026 以2.0%接种量于LB 肉汤中30 ℃培养24 h，传2 代后，取200 μL 接种于10 mL 含10 μg/mL 卡那霉素的LB 肉汤中，30 ℃培养24 h。将其与10 mL 含有100 μL AHLs 的LB 培养基混合，倒入底层铺有10 mL 素琼脂的平板中。用牛津杯法在每孔加入180 μL 乳酸菌CFS，对照组中加入MRS 肉汤，30 ℃培养24 h 后，用V3 型全自动菌落计数仪记录孔周围出现的不透明的白色浑浊圈直径，每个菌株做3 个平行试验。

1.3.3 乳酸菌粗提物的制备 取100 mL 乳酸菌CFS 置于250 mL 的分液漏斗中，分5 次加入100 mL 乙酸乙酯进行萃取，溶剂加入后振荡，静置分层后收集乳化层于锥形瓶中。在50 ℃120 r/min条件下，真空旋转蒸发至有机溶剂气味消失，收集残留液，真空冷冻干燥成粉末置于-18 ℃冰箱保存。

1.3.4 乳酸菌粗提物对紫色杆菌CV026 及嗜水气单胞菌生长曲线的影响 将活化嗜水气单胞菌LY-2 用LB 肉汤制成约106CFU/mL 菌悬液，在96 孔板中每个孔中添加190 μL 菌悬液，再分别加入10 μL 32.0，24.0，20.0，16.0，8.0，4.0，2.0 mg/mL 的乳酸菌粗提物，对照组为不加乳酸菌粗提物的LB 肉汤，30 ℃培养24 h，每2 h 测定OD595值。

1.3.5 乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响

1.3.5.1 96 孔板法测定嗜水气单胞菌生物膜抑制率 在96 孔板中的每孔加入180 μL 106CFU/mL嗜水气单胞菌LY-2 菌悬液和20 μL 粗提物，对照组添加20 μL MRS 肉汤，30 ℃培养24 h。移出孔内培养液，用200 μL 无菌水清洗3～5 次，加入200 μL 0.4%结晶紫染色5 min，无菌水清洗3 次，60 ℃干燥10 min，每孔加200 μL 95%乙醇，每孔移除150 μL 到另一96 孔板内，酶标仪测定OD595值，每个样品做3 个平行试验。嗜水气单胞菌的抑制率按式（1）计算。

式中，ODcontrol——对照组OD 值；ODQSI——乳酸菌粗提物处理组OD 值。

1.3.5.2 光镜观察 在24 孔板中放入无菌盖玻片（R=1.4 cm），孔内加入1 mL LB 肉汤和10 μL嗜水气单胞菌LY-2 菌悬液及100 μL 乳酸菌粗提物，30 ℃培养24 h 后，超纯水润洗3 次盖玻片，0.4%结晶紫染色20 min，油镜（1 000×）下观察。

1.3.5.3 扫描电镜观察 24 孔板中放入无菌盖玻片（R=1.4 cm），孔内加入1 mL LB 肉汤、10 μL 嗜水气单胞菌LY-2 菌悬液及100 μL QSI 粗提物，30 ℃培养24 h 后，超纯水润洗3 次盖玻片，4 ℃下2.5%戊二醛溶液中固定24 h，超纯水洗涤3 次除去残留的戊二醛，分别用体积分数40%，70%，90%，100%乙醇脱水处理15 min，盖玻片真空干燥，喷金，扫描电镜观察。

1.3.6 乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌AHLs 的降解 参照Romero 等[20]方法稍作修改，取10 μL AHLs 粗提物加入1 mL 不同浓度乳酸菌粗提物中，37 ℃培养24 h。取2 mL 紫色杆菌CV026 与45～50 ℃的25 mL LB 固体培养基混匀倒入底层有10 mL 素琼脂平板中。采用牛津杯打孔法，孔中加入180 μL 样品，30 ℃培养24 h，0.0 mg/mL 的乳酸菌粗提物作为对照，V3 型全自动菌落计数仪记录孔周围出现的紫色圈。

1.3.7 乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌群体感应抑制作用的影响因素 蛋白酶：乳酸菌粗提物pH值调至各蛋白酶最适pH 后，加入木瓜蛋白酶（pH 7.0）、胃蛋白酶（pH 2.0）、胰蛋白酶（pH 7.5）、中性蛋白酶（pH 7.0）和碱性蛋白酶（pH 10.0），使最终质量浓度为1.0 mg/mL，37 ℃孵育2 h，再将pH 值调为初始值。未处理的乳酸菌粗提物为对照，按

1.3.2 节方法测定其抑制群体感应活性。

温度：分别在40，60，80，100，121 ℃条件下处理乳酸菌粗提物30 min，未处理的乳酸菌粗提物为对照，按1.3.2 节方法测定其抑制群体感应活性。

pH 值：用1.0 mol/L NaOH 和1.0 mol/L HCl将菌株上清液的pH 值分别调为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，按1.3.2 节的方法测定其活性。

1.3.8 乳酸菌菌株鉴定

1.3.8.1 生理生化鉴定 选择具有群体感应抑制作用的乳酸菌菌株，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》和《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定[21-22]。

1.3.8.2 16S rRNA 鉴定 取乳酸菌菌株12 h 菌悬液1.0 mL 加入1.5 mL EP 管中，8 000 r/min 离心15 min，用DNA 快速抽提试剂盒提取菌株DNA，使用16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增。正向引物为27f （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），反向引物为1492r （5’ -TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）[23]。PCR 扩增反应体系：Taq PCR Master mix 12.5 μL、DNA 模板1.0 μL、dd H2O 9.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，总体积25 μL。PCR 扩增反应程序：94 ℃2 min 预变性，94 ℃1 min 变性，60 ℃1 min 退火，72 ℃90 s 延伸，72 ℃保持10 min，30 次循环，4 ℃保温。

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，扩增结果用凝胶成像系统观察并拍照。扩增成功的PCR 产物送至上海生物工程股份有限公司测序。测序结果经校对后与NCBI 上GeneBank 数据库中的己有序列进行BLAST 比对，使用MEGA 5.0 软件构建系统发育进化树。

1.3.9 数据处理 试验数据采用SPSS 18.0 进行统计学分析，数据平行3 次，结果用平均值±标准偏差表示，用Origin 8.0 进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 抑制嗜水气单胞菌群体感应乳酸菌的筛选

图1是采用牛津杯打孔法从传统发酵蔬菜中筛选得到的4 株对嗜水气单胞菌QS 有抑制作用的乳酸菌菌株NNL1-5、CY2-4、DLH513 和LT2-2，其抑菌圈直径分别为10.01，11.42，12.88 mm 和10.85 mm，由此表明菌株DLH513 对嗜水气单胞菌QS 抑制作用最强。

图1 乳酸菌对紫色杆菌CV026 产紫色素的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of LAB on violacein production of C.violaceum CV026

2.2 乳酸菌粗提物对紫色杆菌CV026 及嗜水气单胞菌生长曲线的影响

为证明菌株DLH513 对嗜水气单胞菌的抑制作用是通过群体感应而不是抑制菌体生长而发挥作用，研究0.0，2.0，4.0，8.0，16.0，20.0，24.0，32.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物对紫色杆菌CV026 及嗜水气单胞菌生长的影响，结果见图2。与对照相比，2.0，4.0，8.0，16.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物处理的紫色杆菌CV026 及嗜水气单胞菌生长曲线呈正常生长趋势，24 h 时OD 值分别达到1.02和0.86；20.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物处理的紫色杆菌CV026 及嗜水气单胞菌OD 值分别下降至0.52 和0.64；24.0，32.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物处理的嗜水气单胞菌及紫色杆菌CV026 的生长曲线明显下降，OD 值分别下降至0.43 和0.20，表明24.0，32.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物能够抑制嗜水气单胞菌及紫色杆菌CV026 的生长。因此，选择16.0 mg/mL 的菌株DLH513 粗提物做下一步试验。

2.3 乳酸菌粗提物对生物膜形成的影响

利用96 孔板法测定8.0，16.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 生物膜抑制率分别为21.7%和40.9%。图3是菌株DLH513粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 生物膜影响的光镜和电镜观察结果，可以看出对照组图3a 中嗜水气单胞菌LY-2 菌株紧密生长，试验组图3b 菌株生长稀疏；对照组图3c 中嗜水气单胞菌LY-2 形成的生物膜较完整，试验组图3d 中嗜水气单胞菌LY-2 生长稀疏，不能形成大量的生物膜，由此表明菌株DLH513 粗提物对嗜水气单胞LY-2 菌生物膜的形成有抑制作用。Santhakumari 等[24]研究发现海洋蓝藻提取物（50～200 μg/mL）对哈维氏弧菌的生物膜抑制率达到25.0%，37.0%，53.0%和71.0%，而在创伤弧菌中，分别高达33.0%，47.0%，62.0%和84.0%，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析表明与对照相比，200 μg/mL 质量浓度的提取物有效分解了生物膜，本试验与此研究结果相似。

图2 菌株DLH513 粗提物对紫色杆菌CV026 和嗜水气单胞菌LY-2 生长曲线的影响Fig.2 Effect of strain DLH513 crude extraction on growth curves of C.violaceum CV026 and A.hydrophila LY-2

图3 菌株DLH513 粗提物对嗜水气单胞菌生物膜形态的影响Fig.3 Effect of strain DLH513 crude extraction on biofilm microscopic of A.hydrophila

2.4 乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌的信号分子的降解

图4是菌株DLH513 粗提物降解嗜水气单胞菌LY-2 AHLs 的试验结果。图中可以看出，与对照组相比16.0 mg/mL 的菌株DLH513 粗提物处理的AHLs，紫色圈直径明显减小，降解率为51.1%；20.0 mg/mL 的菌株DLH513 粗提物处理的AHLs被完全降解。由此表明，菌株DLH513 粗提物可以通过降解嗜水气单胞菌LY-2 信号分子AHLs。这与Naik 等[25]研究发现在Calibrin Z 粘土对哈维氏弧菌（V.harveyi）的群体感应具有显著淬灭或干扰作用相近。

2.5 乳酸菌粗提物对嗜水气单胞菌群体感应抑制作用的影响

图5是不同蛋白酶处理的菌株DLH513 粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 群体感应抑制作用的影响结果。可以看出蛋白酶处理的粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 群体感应丧失抑制。由此说明菌株DLH513 粗提物具有蛋白质特性。表2是不同温度和pH 处理的菌株DLH513 粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 群体感应抑制作用的影响结果，结果显示，40，60，80，100 ℃和121 ℃处理的粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 群体感应抑菌活性无显著差异（P＞0.05），表明菌株DLH513 粗提物具有较好的耐热性；pH 3.0～4.5 处理的粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 群体感应的抑制活性随着pH 值的升高逐渐降低，pH 5.0～6.0 处理的粗提物无抑制活性，由此表明粗提物在低酸性条件下具有较好的抑制活性。

图4 菌株DLH513 粗提物对嗜水气单胞菌LY-2 AHLs 的降解Fig.4 AHLs-degradation of A.hydrophila LY-2 by crude extraction of strain DLH513

图5 菌株DLH513 粗提物对蛋白酶的敏感性Fig.5 Effect of protease on the activity of crude extraction of strain DLH513

表2 温度和pH 处理对菌株DLH513 粗提物的影响Table 2 Effect of temperature and pH on strain DLH513 crude extraction

2.6 乳酸菌菌株鉴定

表3是乳酸菌DLH513 生理生化鉴定结果，对照文献[21]初步判定菌株DLH513 为乳杆菌属植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

图6是菌株DLH513 的16S rRNA 基因扩增电泳图，图中菌株DLH513 在1 500 bp 左右出现特异性亮带，表示目标片段扩增成功，扩增产物送至生物工程（上海）股份有限公司测序，获得其核苷酸序列。测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，构建系统发育树见图7，图中可看出菌株DLH513 与AB889712.1 （Lactobacillus plantarum）在同一分支上，置信度为100%。因此，鉴定菌株DLH513 为植物乳杆菌 （Lb.plantarum），此鉴定结果与生理生化鉴定结果相一致。

表3 菌株DLH513 的生理生化鉴定结果Table 3 Physiological and biochemical test results of strain DLH513

图6 菌株DLH513 的16S rRNA 基因扩增电泳图Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain DLH513

图7 菌株DLH513 的16S rRNA 系统发育树Fig.7 The phylogenetic tree for sequences of strain DLH513

3 结论

本研究从辽宁大连酸黄瓜中获得对嗜水气单胞菌群体感应及生物膜形成具有抑制作用的乳酸菌菌株DLH513，菌株粗提物质量浓度16.0 mg/mL可降低嗜水气单胞菌生物膜生成量，且可降解嗜水气单胞菌群体感应AHLs 信号分子，降解率为51.1%。通过蛋白酶、温度、pH 值对菌株粗提物抑制作用的研究发现菌株粗提物具有蛋白特性，并具有热稳定性，且在低酸性条件下较稳定。经生理生化和16S rRNA 鉴定菌株DLH513 为植物乳杆菌（Lb.plantarum）。本研究从传统腌渍蔬菜中获得具有抑制群体感应特性的乳酸菌，为挖掘细菌作为革兰氏阴性菌群体感应抑制剂资源提供借鉴与参考，也为寻找新型安全绿色的微生态制剂提供了一条新途径。