胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶Pn4CL基因的克隆及表达分析

范睿 胡丽松 伍宝朵 郝朝运

摘  要：根据胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase， 4CL）基因的部分序列设计引物，运用RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA，命名为Pn4cl，长度2130 bp，开放阅读框1638 bp，编码545个氨基酸。预测Pn4CL分子量为59.57 kDa，理论等电点为5.70。该基因含有AMP-binding（AMP-binding enzyme）、CaiC[Acyl-CoA synthetase （AMP-forming） /AMP-acid ligaseⅡ]、PLN02246、AFD-class I等结合域，具有植物4CL所共有的保守结构域。系统进化分析表明，Pn4CL与北细辛的同源性最高，同时与木兰分支类植物的4CL聚类在一起，与菊分支的进化距离较近，与蔷薇分支的进化距离较远。亚细胞定位表明，该蛋白定位在细胞膜上。Real-time RT-PCR结果表明，该基因受外援激素SA和MeJA诱导表达，同时接种辣椒疫霉菌后，Pn4CL基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象，并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn4CL的功能研究提供了理论依据。

关键词：胡椒;4-香豆酸：辅酶A连接酶;克隆与表达

中图分类号：S188      文献标识码：A

Abstract： The full-length cDNA encoding 4-coumarate：coenzyme A ligase （4CL）， designated as Pn4CL， was isolated from black pepper using RACE. The sequence of Pn4CL was 2130 bp in length， containing a 1638 bp open reading frame， and encoding a polypeptide of 545 amino acids with a calculated molecular weight of 59.57 kDa and a PI of 5.70. The protein had four conserved domains of AMP-binding （AMP-binding enzyme）， CaiC （Acyl-CoA synthetase （AMP-forming）/AMP-acid ligase）， PLN02246， AFD-class I. Pn4CL had a closer relationship with Asarum heterotropoides and far from the evolution of Rosids by phylogenetic analysis. The subcellular localization indicated that the protein was on the cell membrane. The expression of Pn4CL could be regulated by exogenous MeJA and SA. When infected with Phytophthora capsici Leon， the expression of Pn4CL was significantly higher in the resistant germplasm than that in the susceptible germplasm by real-time RT-PCR.

Keywords： Piper nigrum; 4-coumarate：coenzyme A ligase （4CL）; cloning and expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.015

胡椒（Piper nigrum）有非常重要的药用和工业价值[1-3]。我国胡椒的种植主要分布在海南、云南等省区，是世界第5大胡椒生产国，年产量可达4.12×104 t[4]。目前热引1号（P. nigrum cv. Reyin-1）为我国胡椒主栽品种，推广面积已经占全国90%以上。但该品种对胡椒瘟病高感染，严重时直接导致减产甚至死亡。胡椒瘟病是一种气候依赖型、传染力很强的土传性病害，主要由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leon）引起的[5]。生产上仍采取预防为主、综合防治为辅的措施，国际尚未选育出有效的抗病品种，主要用高毒化学杀菌剂，极易造成环境污染，且效果不佳[6]。胡椒主栽品种抗瘟病能力差，已成为影响包括我国在内的世界胡椒产业健康发展的瓶頸问题。……