mTOR抑制剂PP242对高糖诱导足细胞损伤保护机制的实验研究

邵金金，刘新艳

糖尿病肾病是糖尿病的慢性微血管并发症之一，蛋白尿是糖尿病肾病的主要临床表现，若病情持续进展，最终发展为慢性肾衰竭。肾小球滤过屏障受损是蛋白尿产生的主要因素，而足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，足细胞结构和功能的完整性与蛋白尿的产生关系密切。高糖引起的足细胞损伤包括足细胞肥大、足细胞凋亡等。有研究表明，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂(如雷帕霉素)对高糖引起的足细胞损伤可能具有保护作用[1]。本研究观察高糖诱导的小鼠肾足细胞增殖与凋亡、裂孔隔膜分子Podocin表达的变化以及新一代mTOR抑制剂PP242的干预作用，探讨PP242对高糖诱导足细胞损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 RPMI1640培养基购自Hyclone公司，PP242 购自美国Cayman公司，小鼠γ-干扰素购于赛业生物，兔抗小鼠Podocin多克隆抗体、小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购于美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记二抗购于中杉金桥生物公司，胎牛血清购于四季青公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂购于碧云天生物技术公司。PP242用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，配制成100 mmol/L的储存液，过滤以后进行分装，分装好的PP242冻存。

1.2 足细胞培养及传代 小鼠肾足细胞购于北纳生物。足细胞首先培养于含10%胎牛血清、50 U/mL小鼠γ-干扰素的1640培养液中，置于33 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养，当细胞生长至70%～80%融合度时，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(含0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA)消化传代，然后转入不含γ-干扰素但含10%胎牛血清的1640培养液中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，诱导分化7～14 d后进行实验。……