大黄素对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠FGL2凝血酶原酶的影响∗

温秀梅 蔡丹莉 严茂祥 何琼笑 王 斌

（1.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310005；2.浙江省中医院，浙江 杭州 310018）

重症急性胰腺炎（SAP）易发生组织坏死，影响全身重要脏器功能，其中肺是最易累及的器官。调查显示，肺损伤是导致SAP患者死亡的重要原因［1］，因此，治疗和预防急性肺损伤对降低SAP死亡率及改善疾病预后具有重要意义。SAP肺损伤的发病机制尚未完全明了，到目前为止，对SAP肺损伤的治疗仍然有限［2］。近年来有研究发现，纤维蛋白原样2（FGL2）凝血酶原酶与SAP的发病密切相关，且参与急性重症呼吸系统综合征［3-5］。大黄素是大黄的主要有效单体之一，在急性胰腺炎治疗中发挥了多方面作用［6-7］。项目组前期研究发现大黄素可有效抗SAP肺损伤，其机制可能与其调控Notch/Hes信号通路促进肺组织炎症细胞凋亡及调节肺组织中TLR4和TLR9的表达有关［8-9］。为进一步研究大黄素抗SAP肺损伤的机制，本实验以FGL2凝血酶原酶为切入点，探讨大黄素通过调节凝血功能抗SAP相关肺损伤的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Sprague-Dawley（SD）大鼠120只，雄性，SPF级，230～250 g，由上海西普尔－必凯实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 药物与试剂 牛磺胆酸钠：纯度＞95%，为美国Sigma-Aldrich公司提供（产品号：86339）；大黄素：纯度＞90%，南京泽朗医药科技有限公司提供，临用前以4%蔗糖脂肪酸酯配成大黄素混悬液；总RNA纯化提取试剂盒（产品号：9767）、cDNA合成试剂盒（产品号：RR036A）、SYBR Premix Ex Taq® Ⅱ（TliRNaseH Plus）（产品号：RR820A）为宝生物工程（大连）有限公司产品；全蛋白提取试剂盒（产品号：KGP2100）为江苏凯基生物技术股份有限公司产品；BCA定量试剂盒（产品号：PQ0012）、Rat TNF-α High sensitivity ELISA Ki（t产品号：EK382HS）为杭州联科生物技术有限公司产品；FGL2鼠单抗（产品号：H00010875）为Abnova公司产品；血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）ELISA试剂盒为南京建成生物技术有限公司产品。

1.3 造模与干预 120只大鼠随机数字法分为5组：假手术组、模型组、大黄素高剂量组、大黄素中剂量组、大黄素低剂量组各24只，每组又分3、6、12 h 3个时相点，每个时相点8只。假手术组仅开腹暴露并轻微翻动胰腺组织后即关腹。其余4组采用开腹胰胆管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠的方法造模建立SAP肺损伤模型。大黄素高、中、低剂量组在造模前和造模后1 h分别腹腔注射大黄素混悬液40、20、10 mg/kg（大黄素剂量根据文献及前期预试［6-7］选择），假手术组和模型组在造模前和造模后1 h腹腔注射等量的（和大黄素各组相同容积的）4%蔗糖脂肪酸酯溶液。

1.4 标本采集与检测

各组大鼠分别在造模后3、6、12 h处死大鼠并分离肺组织。1）采用qRT-PCR技术检测肺组织FGL2凝血酶原酶、TNF-α mRNA表达；2）免疫组化技术检测FGL2凝血酶原酶蛋白表达；3）采用蛋白提取试剂盒提取肺组织全蛋白，BCA法进行蛋白定量，ELISA检测大鼠肺组织蛋白提取物的TNF-α水平；4）以生理盐水制备肺组织匀浆，取上清液采用ELISA检测TXB2、6-Keto-PGF1α的水平。

1.5 统计学处理

应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，正态分布（非正态分成转换成正态分布）采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD进行两两比较，方差不齐性采用Dunnett′s T3采用进行两两比较；计量资料采用非参数秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织FGL2 mRNA和蛋白表达比较 见表1～表2，图1。模型组3、6、12 h 3个时相点大鼠肺组织FGL2 mRNA和蛋白表达较假手术组同一时相点明显增高（P＜0.01）；大黄素高、中剂量组各时相点以及大黄素低剂量组3、6 h时相点FGL2 mRNA和蛋白表达较模型组同一时相点明显下调（P＜0.05或P＜0.01），大黄素高剂量组12 h时相点FGL2 mRNA和蛋白表达较大黄素低剂量组同一时相点明显下调（P＜0.05）。

表1 各组大鼠不同时点肺组织FGL2 mRNA表达比较（±s）

表1 各组大鼠不同时点肺组织FGL2 mRNA表达比较（±s）

与假手术组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与大黄素高剂量组比较，#P＜0.05。下同

组别n 3 h 6 h 12 h 24 24 24 24 24假手术组模型组大黄素高剂量组大黄素中剂量组大黄素低剂量组1.16±0.13 1.59±0.30**1.20±0.25△△1.16±0.19△△1.17±0.34△△1.07±0.46 2.66±0.64**1.18±0.42△△1.34±0.23△1.36±0.20*△1.02±0.20 2.68±0.53**1.54±0.34**△△1.71±0.50**△△2.14±0.60**#

表2 各组大鼠不同时点肺组织FGL2蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠不同时点肺组织FGL2蛋白表达比较（±s）

组别n 3 h 6 h 12 h 24 24 24 24 24假手术组模型组大黄素高剂量组大黄素中剂量组大黄素低剂量组1.12±0.99 3.69±0.65**2.56±0.73**△2.62±0.69**△2.87±0.58**△1.25±0.89 4.12±0.83**2.69±0.70**△△2.94±0.78**△3.00±0.80**△1.56±0.42 4.31±0.70**2.75±0.60**△△3.00±0.65**△△3.44±0.90**#

图1 各组大鼠肺组织FGL2蛋白表达比较（免疫组化染色，100倍）

2.2 各组大鼠肺组织TXB2、6-Keto-PGF1α水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值比较 见表3。模型组3、6、12 h 3个时相点大鼠肺组织TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值较假手术组同一时相点明显增高（P＜0.01），6-kKeto-PGF1α水平与假手术组比差异无统计学意义（P＞0.05）；大黄素高、中剂量组各时相点TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值较模型组同一时相点明显下降（P＜0.05或P＜0.01），大黄素低剂量组6、12 h时相点TXB2水平以及12 h时相点TXB2/6-Keto-PGF1α较模型组同一时相点明显下降（P＜0.05或P＜0.01）；大黄素高、中、低剂量组各时相点6-Keto-PGF1α水平与模型组同一时相点差异也无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠不同时间点肺组织TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-keto-PGF1α水平比较（±s）

表3 各组大鼠不同时间点肺组织TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-keto-PGF1α水平比较（±s）

组别假手术组（n=8）模型组（n=8）大黄素高剂量组（n=8）大黄素中剂量组（n=8）大黄素低剂量组（n=8）时间3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h 3 h 6 h 12 h TXB2（pg/mg）57.22±18.04 54.58±15.22 61.24±21.91 106.73±21.46**130.10±33.23**136.03±17.35**76.73±26.68△86.14±22.06*△△89.48±26.80**△△80.74±18.54*△92.38±26.32*△96.31±19.92*△△90.89±18.91*100.28±24.83**△109.61±22.18*△6-Keto-PGF1α（pg/mg）4 361.99±703.78 4 871.38±573.00 4 656.75±797.94 4 970.08±506.59 5 415.67±562.55 5 590.39±401.27 5 103.44±827.39 5 521.65±790.87 5 588.72±520.98 5 147.14±685.22 5 302.54±663.63 5 425.15±701.21 5 037.07±400.54 5 467.94±767.50 5 445.91±715.01 TXB2/6-keto-PGF1α 0.013±0.003 0.011±0.002 0.013±0.004 0.021±0.003**0.024±0.004**0.024±0.004**0.015±0.003△0.015±0.002*△△0.016±0.003△△0.016±0.004△0.017±0.003**△△0.018±0.002*△△0.018±0.005*0.019±0.003**△△0.020±0.002*△

2.3 各组大鼠肺组织TNF-α mRNA和蛋白表达比较 见表4～表5。模型组3、6、12 h 3个时相点大鼠肺组织TNF-α mRNA和蛋白表达均较假手术组同一时相点明显增高（P＜0.01）；大黄素高、中、低剂量组各时相点TNF-α mRNA和蛋白表达较模型组同一时相点均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各组大鼠不同时点肺组织TNF-α mRNA表达比较（±s）

表4 各组大鼠不同时点肺组织TNF-α mRNA表达比较（±s）

组别正常组模型组大黄素高剂量组大黄素中剂量组大黄素低剂量组n 8 8 8 8 8 3 h 1.27±0.13 2.14±0.87*1.24±0.64△△1.26±0.45△1.31±0.40△6 h 1.02±0.21 2.42±0.62**1.19±0.32△△1.42±0.38*△△1.40±0.65△△12 h 1.06±0.40 2.57±0.46**1.44±0.30*△△1.62±0.60**△△1.78±0.56**△

表5 各组大鼠不同时点肺组织TNF-α水平比较（pg/mg，±s）

表5 各组大鼠不同时点肺组织TNF-α水平比较（pg/mg，±s）

组别假手术组模型组大黄素高剂量组大黄素中剂量组大黄素低剂量组n 8 8 8 8 8 3 h 5.38±0.34 8.89±0.36**6.61±0.54**△△6.33±0.65*△△7.11±1.15*△6 h 5.45±0.22 9.73±0.49**6.91±1.01*△△7.08±0.68**△△7.59±1.39*△12 h 5.91±0.79 10.10±0.52**7.27±0.92**△△7.28±0.82**△△7.79±1.18**△△

3 讨 论

急性肺损伤是SAP早期并发症之一，SAP相关肺损伤发病机制复杂，目前多数观点认为急性炎症在SAP及其相关肺损伤形成中发挥关键作用［10］，同时也有学者认为凝血功能紊乱与胰腺微循环障碍和全身炎症反应综合征有密切关系［11］。FGL2凝血酶原酶属于纤维蛋白原家族，是一种促凝因子，在微血栓形成中起着关键作用，与细胞凋亡、血管生成和炎症反应有关［12-14］，是联系炎症和凝血的关键蛋白。有研究证明FGL2凝血酶原酶可能通过介导胰腺内微血栓的形成而促进SAP的发生与发展［3］，SAP大鼠肝组织中FGL2凝血酶原酶基因和蛋白表达显著上调，FGL2凝血酶原酶的表达升高与肝细胞损伤的严重程度及病理分级呈正相关［4］，腺病毒介导的人工小RNA靶向FGL2，在牛磺胆酸诱导的小鼠胰腺炎模型中显著抑制了FGL2的表达，改善了SAP早期的凋亡，改善了炎症，从而起到保护作用，减轻了胰腺损伤［5］。本实验经胰胆管逆行注入牛磺胆酸钠建立大鼠SAP肺损伤模型，发现肺组织中FGL2 mRNA和蛋白的表达较假手术组显著增加，同时3个时相点大鼠肺组织TNF-α分泌水平较假手术组明显增高、TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值较假手术组同一时相点明显增高，提示FGL2凝血酶原酶可能通过介导肺组织微循环障碍而促进SAP肺损伤炎症的发生与发展。

根据SAP多表现为腹痛、呕吐、便结、黄疸等症状，属于中医“厥脱”“阳明腑实证”等范畴，中医认为SAP是由于肝胆失疏、温热蕴结，或上迫于肺，或内陷心包，或热伤血络，因此，中医将通里攻下、活血化瘀、清热解毒作为治疗该症的基本治则。大黄具有荡涤肠胃、攻下泻火、清热解毒、活血化瘀等功效，对SAP有积极治疗的作用，是临床上治疗AP的要药［15］。大黄素是大黄的主要有效单体之一，项目组前期的研究也发现，大黄素能明显降低SAP肺损伤大鼠血清淀粉酶活性，改善胰腺、肺组织炎症和组织结构损伤［8，16］。本研究进一步发现，大黄素可明显下调SAP肺损伤大鼠肺组织中FGL2、TNF-α mRNA和蛋白表达，同时还可降低TXB2水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值，提示大黄素可能通过下调FGL2凝血酶原酶和TNF-α的表达，减少血栓素合成及释放，从而抑制肺组织的过度炎症反应，防止血小板聚集和血栓形成，这是其抗SAP肺损伤的重要作用机制。