桦褐孔菌多糖经Nrf2信号通路对糖尿病大鼠视网膜组织氧化应激和炎症反应的抑制作用△

杨雪 左中夫

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的微血管并发症。研究证实，DR的发生与氧化应激和炎症反应密切相关。机体内Nrf2信号通路是保护正常细胞免受活性氧、氧化应激以及外源性损伤的主要细胞信号通路[1]。当受到氧化活性物质刺激时，Nrf2与AU富含元件结合，释放下游的靶基因，调控抗氧化酶和Ⅱ相代谢酶基因的转录[2]，发挥抗氧化应激作用。桦褐孔菌是一种寄生在白桦、榆树和银桦等树干或树皮上的真菌。吕金玲等[3]研究表明，桦褐孔菌多糖能有效降低血糖浓度，起到抗氧化应激的作用。本研究探讨桦褐孔菌多糖经Nrf2信号通路对糖尿病大鼠视网膜组织氧化应激和炎症反应的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组及模型构建选取12周龄雄性SD大鼠40只(体质量200～300 g，购自锦州医科大学实验动物中心)，每天给予大鼠标准颗粒饲料，自由饮水；环境温度为20～25 ℃，相对湿度为40%～60%。将实验大鼠在标准条件下正常饲养1周后随机分为4组：正常对照组10只、糖尿病组10只、IOP组(给予大鼠桦褐孔菌多糖300 mg·kg-1)10只和抑制剂组(给予大鼠桦褐孔菌多糖300 mg·kg-1+锌原卟啉20 mg·kg-1)10只。除正常对照组外，其余大鼠均采用一次性腹腔注射10 g·L-1链脲佐菌素(60 mg·kg-1)制作糖尿病大鼠模型，并于给药后48 h和72 h后分别测量尾静脉血糖浓度，当血糖浓度≥16.7 mmol·L-1时，认为造模成功。桦褐孔菌多糖采用灌胃法给药；抑制剂组在桦褐孔菌多糖灌胃前24 h将锌原卟啉20 mg·kg-1经腹腔注射给大鼠。正常对照组和糖尿病组灌胃相同体积的生理盐水,并于12周后禁食不禁水12 h后进行实验。

1.1.2 主要试剂与仪器链脲佐菌素(美国Sigma公司)，桦褐孔菌多糖(延边高丽酿造有限公司)，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，兔抗大鼠Nrf2多克隆抗体、兔抗大鼠HO-1多克隆抗体、兔抗大鼠COX-2多克隆抗体、山羊抗兔IgG(广州欧边生物制品有限公司)，万能显微镜和照相机(日本OLYMPUS公司)，石蜡切片机、DFC295成像系统(德国LEICA公司)，全自动生化分析仪(上海泰医医疗仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样本采集将大鼠麻醉后，用40 g·L-1多聚甲醛灌注心脏，立即取一侧眼球，保留视神经，去除多余组织，固定于FFA固定液10 min后，再用40 g·L-1多聚甲醛固定24 h。石蜡包埋，切片，厚度为5 μm，用于HE染色和免疫组织化学染色。分离的新鲜视网膜继续冰冻用于Western blot检测。

1.2.2 视网膜样品组织中MDA、GSH、SOD含量检测测量大鼠体质量，取静脉血，采用全自动生化分析仪测定大鼠空腹血糖浓度。处死大鼠，摘取另一侧眼球制成组织匀浆，严格遵照MDA、GSH、SOD试剂盒的说明书来测定视网膜样品组织中MDA、GSH、SOD含量。

1.2.3 采用HE染色观察视网膜形态并检测视网膜神经节细胞密度用苏木精浸染视网膜切片3 min，水洗后移入分化液中分化30 s，使切片退至淡蓝红色，放入水中洗涤5 min，移入伊红液中浸染 90 s，水洗擦干后用梯度酒精脱水各2 min。最后置于二甲苯中透明处理，封片，用显微镜观察视网膜形态，并计算神经节细胞数量，分析其密度变化。

1.2.4 免疫组织化学染色观察视网膜细胞HO-1阳性染色情况将视网膜切片常规脱蜡入水，梯度酒精脱水，之后转移至PBS缓冲液中孵育5 min，再用过氧化氢孵育10 min，在正常山羊血清中室温封闭30 min后，去除封闭液，滴加一抗工作液,4 ℃孵育过夜。用PBS清洗切片2次后，滴加二抗工作液，室温孵育20 min，再次用PBS清洗擦干切片后滴加新鲜的DAB工作液，在显微镜下观察视网膜细胞染色情况。随后，用苏木素复染2 min，水洗切片，进行脱水封片,计算阳性细胞率。

1.2.5 采用Western blot法检测视网膜HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的表达取冷冻的视网膜组织，加入4倍体积的细胞裂解液；取上清，加入考马斯亮兰，用Bradford 法测定蛋白含量；将玻璃板放置在架子上进行灌胶和上样，电泳4～5 h后进行转膜。利用半干法将目的蛋白转移到PVDF膜上，用丽春红染色后，置于脱色摇床上摇5 min。用PBS清洗1次后浸入脱脂奶粉封闭液，置于摇床上过夜，用PBS洗3次，每次5 min。采用ECL试剂盒显色，检测 HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的表达水平。

1.3 统计学分析应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示；采用单因素方差分析或双因素方差分析进行各组间比较。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 造模前后各组大鼠体质量和血糖浓度比较4组大鼠造模前体质量和血糖浓度差异均无统计学意义(均为P>0.05)。造模后12周，糖尿病组、IOP组、抑制剂组大鼠体质量均低于正常对照组，血糖浓度均高于正常对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；IOP组大鼠血糖浓度均<16.7 mmol·L-1，糖尿病组和抑制剂组血糖浓度均大于该值。见表1。

表1 造模前后各组大鼠体质量和血糖浓度比较

2.2 造模后各组大鼠视网膜组织中SOD、GSH和MDA的含量比较造模后，各组大鼠视网膜组织中SOD、GSH和MDA的含量检测结果见表2。由表2可见:糖尿病组大鼠视网膜组织中SOD、GSH的含量明显低于正常对照组(均为P<0.01);MDA含量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。IOP组视网膜组织中SOD、GSH含量高于糖尿病组及抑制剂组，MDA含量显著低于糖尿病组及抑制剂组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

表2 造模后各组大鼠视网膜组织中SOD、GSH和MDA的含量

2.3 各组大鼠视网膜形态及神经节细胞计数HE染色后显微镜观察结果显示，正常对照组和IOP组大鼠视网膜各层结构清晰，排列整齐；糖尿病组和抑制剂组大鼠视网膜分层模糊，各层排列紊乱，细胞水肿明显(图1)。正常对照组、糖尿病组、抑制剂组和IOP组视网膜神经节细胞密度分别为(2300±100)个·mm-2、(1400±100)个·mm-2、(1505±95)个·mm-2、(2250±95)个·mm-2。正常对照组和IOP组神经节细胞密度均高于糖尿病组(均为P<0.01)；抑制剂组神经节细胞密度低于IOP组，差异有统计学意义(P<0.01)；而正常对照组与IOP组神经节细胞密度相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组大鼠视网膜HE染色 A：正常对照组；B：糖尿病组；C：抑制剂组；D：IOP组。箭头示视网膜神经节细胞

2.4 各组大鼠视网膜组织中HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的表达免疫组织化学染色结果显示：正常对照组视网膜切片上可见少量HO-1阳性表达点，其他3组HO-1阳性表达点增多，且IOP组HO-1阳性表达点高于糖尿病组和抑制剂组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot结果显示:糖尿病组HO-1、Nrf2及COX-2蛋白的表达均高于正常对照组(均为P<0.01)。IOP组大鼠视网膜组织中HO-1、Nrf2蛋白表达高于糖尿病组，COX-2蛋白的表达低于糖尿病组(均为P<0.01)；抑制剂组大鼠视网膜组织中HO-1、Nrf2蛋白表达低于IOP组，COX-2蛋白的表达高于IOP组，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。见表3。

表3 造模后各组大鼠视网膜组织中HO-1、Nrf2和COX-2蛋白的相对表达量

3 讨论

随着人们生活水平的提高，加之其他诸多因素的影响，糖尿病患病率不断升高。据统计，2011年，全球大约有3.66亿糖尿病患者，到2030年这个数字预测将增加到5.52亿[4]。糖尿病的并发症是导致糖尿病患者病情恶化，致残和致死的重要原因[5]。

DR是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是导致世界范围内成年人视力丧失的主要原因[6]，严重影响患者的生活质量。DR的发生与发展与多个因素有关，主要包括多元醇通路、高级糖基化终末产物的形成、蛋白激酶C的激活等。以上这些信号通路均可以激活氧化应激反应，生成异常代谢通路，导致视网膜缺血缺氧，加重炎症反应，使氧自由基产生增加，机体抗氧化清除能力降低，细胞凋亡，最终导致视网膜出血、渗出等。SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。GSH作为重要的抗氧化剂，能够清除人体内的自由基，参与体内多种氧化还原反应。MDA是体内自由基作用于脂质发生过氧化的终末产物，可间接反映脂质过氧化水平。本研究发现，糖尿病组大鼠视网膜组织中SOD、GSH的含量明显低于正常对照组，MDA含量高于正常对照组，糖尿病组大鼠视网膜形态结构出现了异常变化，表明在高糖状态下，视网膜氧化与抗氧化系统失衡，清除氧自由基的能力减弱，导致氧化应激损伤增强，细胞遭受自由基的攻击而引起了不可逆性损伤。

Keap1-Nrf2-ARE通路可抵抗来自化学因素、环境因素等多种因素导致的氧化应激反应，是调节机体氧化还原反应的关键通路，激活其可使抗氧化蛋白、抗炎因子的表达上调，减轻机体氧化应激损伤[7]。Nrf2是一种细胞内转录因子，它参与细胞氧化应激等多种防御机制。Nrf2 处于静止期时主要位于胞质内，当受到氧化活性物质刺激时，Nrf2 转位进入细胞核内，再与ARE启动子部位结合，释放下游的靶基因，调控抗氧化酶(主要包括HO-1、过氧化物酶-1、SOD、GSH-Px和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶等)和Ⅱ相代谢酶(主要包括谷胱甘肽-S-转移酶、NQO1、葡萄糖醛酸转移酶1A6等)基因的转录活动[8],从而可以清除细胞内活性氧自由基和炎症因子，降低血清中MDA的含量，降低机体内氧化还原反应，发挥抗氧化及抗炎的作用[9]。HO-1是氧化应激的重要参与者，且极易被诱导。在本研究中，糖尿病组大鼠视网膜组织中Nrf2及HO-1的表达高于正常对照组，HO-1的表达由细胞质转位于细胞核，表明在高糖状态下，机体启动了Nrf2/ARE信号通路，使下游的抗氧化酶HO-1被激活，增强了细胞的抗氧化能力。目前，COX-2被公认为重要的炎症因子，是花生四烯酸代谢的一种重要酶[10]，其与炎症、肿瘤等病理状态下新生血管的生成密切相关，并参与了DR的病理过程[11]。在高糖的病理状态下，核转录因子-κB、白细胞介素-6等炎症因子作为顺式作用元件，上调COX-2的表达[12]，COX-2催化花生四烯酸生成前列腺素，产生缩血管前列腺素，损害血管内皮的功能[13]，促进DR的进一步发展。COX-2的表达量与炎症反应密切相关，在本研究中我们发现，糖尿病组大鼠视网膜组织中COX-2表达较正常对照组增多，表明氧化应激伴随炎症反应增强，加快了DR的进展。

桦褐孔菌，又名白桦茸，是一种寄生在白桦、榆树和银桦等树干或树皮上的药用真菌[14]。桦褐孔菌中含有200多种生物活性物质[15]，其中桦褐孔菌多糖被认为是潜在的保健成分[16]，也是公认的有效降糖成分。桦褐孔菌多糖能够清除活性氧自由基，抑制细胞间核酸的氧化，增强SOD和过氧化物酶的活性[17]。本研究发现，与糖尿病组大鼠相比，IOP组大鼠血糖浓度明显降低，视网膜组织中SOD、GSH含量显著增高，MDA含量显著降低，视网膜各层结构未见异常，提示桦褐孔菌多糖可以有效地降低血糖浓度，减轻氧化应激反应，具有抗氧化作用。锌原卟啉为HO-1抑制剂，本研究发现，IOP组大鼠Nrf2、HO-1的表达较糖尿病组上调明显，而COX-2表达明显下降，加入锌原卟啉后，下调了Nrf2、HO-1的表达，上调了COX-2的表达。这些均提示桦褐孔菌多糖能够激活Nrf2信号通路并上调其下游抗氧化蛋白的表达，降低DR大鼠视网膜氧化应激及炎症反应。

综上所述，桦褐孔菌多糖能够对DR起到对抗作用，其机制与激活Nrf2信号通路有关。