miR-140-5p靶向Nrf2对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞氧化应激的调节作用△

张新霞 陆丽红 狄文玉 王小敏 王保君

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的主要微血管并发症之一，最终可引起患者视力下降甚至失明[1]。然而，目前对该病病理发生机制的认识仍十分有限，且现有的治疗手段仍不能达到较为理想的效果，因此，深入探讨该病的分子生物学机制仍具有重要意义。microRNAs(miRNAs)通过碱基互补配对同靶mRNA结合，抑制基因表达从而达到调节各项细胞功能的作用，miRNAs参与调节细胞代谢和凋亡等过程[2-3]，研究表明，miR-140-5p在糖尿病患者中表达上调[4-5]。然而，miR-140-5p是否参与调控DR的发生发展及其潜在机制尚未明确。核因子-类胡萝卜素2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是肿瘤防御的一个重要因子[6]，在细胞对抗外来异物和氧化损伤中发挥至关重要的作用[7]。本研究拟探讨miR-140-5p是否通过靶向Nrf2，在高糖诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞氧化应激过程中发挥调控作用，为 DR的临床治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料ARPE-19细胞株购自广州吉妮欧生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素、SYBR-Green Real-Time PCR Master均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；TRIzol、LipofectamineTM2000试剂购于美国Invitrogen公司；RT Master Mix(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex TaqTM检测试剂盒均购自日本Takara Bio公司；cDNA反转录试剂盒购自美国Applied Biosystems公司；基因引物购自中国GenScript公司；CCK-8试剂盒购自德国Roche公司；1×binding缓冲液购于美国Sigma-Aldrich公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)酶活性试剂盒购于南京建成生物工程研究所；荧光素酶检测报告试剂盒购于中国碧云天公司。

1.2 细胞培养及高糖处理在含有体积分数10%胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM完全培养基中培养ARPE-19细胞，并置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中孵育。培养基每周更换2～3次。高糖处理：细胞培养基中分别加入5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1的葡萄糖，48 h后收获细胞，CCK-8法检测各组细胞存活率，RT-qPCR检测各组细胞miR-140-5p和Nrf2 mRNA的表达情况。

1.3 细胞转染及分组处理使用LipofectamineTM2000质粒，按照说明书流程，将miR-140-5p inhibitor、miR-140-5p-NC、miR-140-5p-mimic、si-Con或si-Nrf2转染入ARPE-19细胞，根据转染物不同，分为空白对照组(转染miR-140-5p-NC)、过表达组(转染miR-140-5p-mimic)、干扰组(转染miR-140-5p-inhibitor)；转染48 h后，RT-qPCR检测3组miR-140-5p和Nrf2 mRNA的表达，荧光素酶报告实验检测Nrf2相对荧光素酶活性。细胞转染48 h后，再经不同浓度葡萄糖处理48 h，根据转染物和葡萄糖浓度不同随机分为对照组(5 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-NC)、高糖对照组(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-NC)、高糖抑制组(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-inhibitor)、高糖空白组(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-NC+si-Con)、高糖miR干预组(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-inhibitor+si-Con)、高糖Nrf2逆转组(50 mmol·L-1葡萄糖+miR-140-5p-inhibitor+si-Nrf2)，收集各组细胞后，检测细胞存活率及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和SOD活性，同时RT-qPCR检测高糖空白组、高糖miR干预组和高糖Nrf2逆转组Nfr2 mRNA的表达。

1.4 CCK-8法检测细胞存活率采用CCK-8试剂盒检测不同处理后的ARPE-19细胞存活率。细胞以每孔5×103个接种于96孔板，孵育48 h后将CCK-8溶液按每孔10 μL添加入培养基中，继续培养1 h后，使用微孔板读数器在450 nm处测量光密度值。

1.5 RT-qPCR检测应用TRIzol试剂提取不同处理后各组ARPE-19细胞RNA。使用RT Master Mix(Perfect Real Time)检测试剂盒将总RNA反转录为cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒行RT-qPCR，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。qPCR为500 ng cDNA和SYBR-Green Real-Time PCR Master混合液，设定PCR程序：94 ℃预变性4 min，94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增40个循环。使用2-ΔΔCt方法定量表达水平，利用Primer 5.0软件设计引物，引物序列为：miR-140-5p 上游引物： 5-’TGCGGCAGTGGTTTTACCCTATG- 3’ ，下游引物：5’- CCAGTGCAGGGTCCGAGGT -3’；U6 上游引物： 5-’TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’ ，下游引物： 5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’； Nrf2 上游引物： 5’-TGAGGTTTCTTCGGCTACGTT-3’ ，下游引物：5’-CTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3’；β-actin 上游引物： 5’-CCACACCTTCTACAATGAGC-3’，下游引物：5’-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3’。

1.6 细胞ROS含量检测使用DCFH-DA荧光探针检测不同处理后ARPE-19细胞内ROS含量。ARPE-19细胞同10 μmol·L-1DCFH-DA在黑暗条件下于37 ℃孵育20 min。PBS洗涤后重悬，将浓度调整为106个·mL-1。使用流式细胞仪(激发波长488 nm，发射波长521 nm)检测具有荧光标记的细胞后，进一步使用FlowJo软件分析荧光强度，并计算细胞ROS含量。

1.7 氧化应激指标检测使用SOD酶活性试剂盒检测各组SOD酶活性，实验步骤严格按照检测试剂盒说明书进行。

1.8 荧光素酶报告基因检测将含有Nrf2启动子的假定结合位点同潜在miR-214-3p结合位点或Nrf2 3’-UTR突变体克隆到质粒中。ARPE-19细胞于含体积分数10% FBS的DMEM培养基培养并用荧光素酶报告质粒转染，48 h后，通过双重荧光素酶测定系统(Promega)测量相对荧光素酶活性。

1.9 统计学分析应用SPSS 20.0软件对所有数据进行分析，数据以均数±标准差表示,行t检验或One-Way ANOVA检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 高糖对细胞存活率及miR-140-5p表达情况的影响CCK-8法检测结果显示，经5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖处理后，ARPE-19细胞的存活率分别为(100.0±2.1)%、(98.9±3.5)%、(96.9±3.8)%、(82.3±3.9)%、(43.7±2.6)%；经统计学处理，与5 mmol·L-1葡萄糖处理后相比，30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖处理后ARPE-19细胞存活率均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.001)，其余浓度组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。经5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖处理后，ARPE-19细胞miR-140-5p相对表达量分别为1.0±0.1、1.2±0.1、1.3±0.1、2.5±0.3、5.4±0.2；经统计学处理，与5 mmol·L-1葡萄糖处理后相比，30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖处理后ARPE-19细胞miR-140-5p相对表达量均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.001)，其余浓度组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

2.2 抑制miR-140-5p对高糖状态下细胞存活率及氧化应激水平的影响RT-qPCR检测结果显示，空白对照组、过表达组、干扰组miR-140-5p相对表达量分别为100.0%±8.2%、351.1%±9.2%、25.3%±5.2%；经统计学处理，与空白对照组相比，过表达组miR-140-5p相对表达量显著增加，干扰组则显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。转染并给予不同浓度葡萄糖处理后，相较于对照组，高糖对照组细胞存活率显著降低，ROS含量显著增加，SOD活性显著降低(均为P<0.001)；相较于高糖对照组，高糖抑制组细胞存活率显著增加，ROS含量显著降低，MDA活性显著增加(均为P<0.01)。见表1。

表1 各组细胞存活率、ROS含量、SOD活性

2.3 miR-140-5p靶向基因 Nrf2的表达5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖处理后的ARPE-19细胞，Nrf2 mRNA相对表达量分别为100.0%±1.5%、97.5%±2.1%、93.2%±2.4%、46.3%±1.9%、31.3%±2.1%；经统计学处理，与5 mmol·L-1葡萄糖处理后相比，30 mmol·L-1、50 mmol·L-1葡萄糖处理后细胞Nrf2 mRNA相对表达量均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.01、P<0.001)，其余浓度组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。荧光素酶报告实验结果显示，空白对照组、过表达组、干扰组Nrf2相对荧光素酶活性分别为100.0%±4.3%、37.5%±3.8%、231.1%±5.7%；经统计学处理，与空白对照组相比，过表达组Nrf2相对荧光素酶活性显著降低，干扰组则显著增多，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。

2.4 干预Nrf2对miR-140-5p介导的细胞存活及氧化应激水平的影响经统计学处理，相较于高糖空白组，高糖miR干预组Nrf2 mRNA相对表达量显著升高，细胞存活率显著增加，ROS含量显著下降，SOD活性显著增加(均为P<0.001)；相较于高糖miR干预组，高糖Nrf2逆转组Nrf2 mRNA相对表达量显著降低，细胞存活率显著降低,ROS含量显著增加,SOD活性显著降低(均为P<0.01)。见表2。

表2 各组Nrf2 mRNA相对表达量、细胞存活率、ROS含量、SOD活性

3 讨论

DR是常见的糖尿病微血管并发症之一，可导致严重的视力障碍甚至失明。RPE细胞在维持视网膜功能中发挥关键作用[8]，RPE细胞损伤和DR的发生关系紧密。由于糖尿病患者长期处于高血糖状态，机体内细胞极易发生黏附分子活化、抗氧化酶损伤等病理性改变，诱发RPE细胞氧化应激的发生，从而引发患者视力下降。

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，通常为基因表达负性调控因子，在多种疾病中发挥调控作用[9]。它们通常与mRNA的特定区域结合并阻止翻译，从而导致其靶蛋白表达水平降低。抑制miRNA的表达，可以引起相关蛋白表达的增加。越来越多的研究发现，在糖尿病发生发展过程中，包括组织代谢变化、胰岛素质量控制、β细胞功能控制及糖尿病并发症发生过程中，miRNA均发挥了重要的作用[10]。Ortega等[11]发现，葡萄糖耐量正常(NGT)者相对于2型糖尿病患者miR-140-5p表达显著增加；miR-140与病态肥胖，尤其是脂肪含量相关，减肥手术后，其表达水平降低。然而，miR-140-5p是否参与调控DR的发生发展仍尚未明确。本研究结果显示，高糖诱导的ARPE-19细胞氧化应激中，当细胞存活率显著性降低时，miR-140-5p表达显著性升高；抑制miR-140-5p表达可显著逆转高糖诱导的细胞存活率下降及氧化应激发生。以上结果说明，miR-140-5p在高糖诱导的氧化应激过程中发挥重要调控作用。Su等[12]的研究结果显示，糖尿病肾病患者肾组织中miR-140-5p表达显著下调，而miR-140-5p可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路从而改善高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和炎症反应，提示miR-140-5p对于高糖环境具有重要的调节作用，与本研究得出的结果具有一定的相似性。

Nrf2是细胞氧化应激反应中的重要转录因子，是维持细胞氧化还原稳态的中枢调节者。外源性有毒物质和氧化应激使Nrf2活化，活化的Nrf2可以清除自由基，上调多种抗氧化酶及解毒酶，提高SOD等抗氧化酶表达水平，维持细胞内氧化还原稳态水平[13]。DR的主要病理过程为高糖诱导RPE细胞发生氧化应激，最终诱发细胞凋亡，导致患者视力下降。该过程是否有Nrf2参与且Nrf2与miR-140-5p间是否存在靶向关系，是本研究核心探讨的问题。虽然目前有报道提示，miR-140-5p可通过靶向Nrf2和Sirt2促进心肌氧化应激，加重阿霉素诱导的心脏毒性[14]；miR-140-5p可通过Keap1独立机制激活Nrf2/ARE途径，减轻顺铂所致急性肾损伤的氧化应激[15]。而在DR研究领域，miR-140-5p靶向作用Nrf2是否为高糖诱发RPE细胞氧化应激发生的重要信号通路，目前尚未完全阐明。本研究结果发现，高糖环境中Nrf2-mRNA表达发生显著性降低，说明Nrf2可能参与了高糖诱导的细胞氧化应激调控，且调控结果同miR-140-5p相反。荧光素酶报告基因检测证明了Nrf2可充当miR-140-5p的靶基因，且最终通过转染si-Nrf2，证明了这一通路在高糖诱导的RPE细胞氧化应激损伤中的作用。

综上，本研究结果表明，miR-140-5p通过调节Nrf2在高糖诱导的RPE细胞氧化应激中发挥重要调控作用，对该机制的进一步研究可能有助于开发新的DR的治疗靶点。