杉木无性系组培苗增殖优化研究

曾碧欣，胡德活，韦如萍，晏 姝，郑会全，王润辉，曾 宏

(1.广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东 广州 510520; 2.广东省林业科学研究院，广东 广州 510520)

良种苗木是营造优质人工林的基础，而组织培养技术作为一种新型的产业化育苗方式，近些年来，已在杉木人工林产业化过程中得到快速发展[1-3]。采用组织培养育苗不仅可以保持母本材料的优良遗传特性，还具有缩短育苗周期、提高繁育效率等优点[4-6]，能够在较短时间内满足市场对优质苗木的迫切需求[7]。但是，在组织培养过程中，随着增殖代数的不断增加，不定芽的长势会逐渐变弱，同时表现出叶片紧凑、叶色偏黄、增殖倍数降低等现象，进而影响不定芽的质量，以及后续的生根和移栽环节。目前，杉木组织培养育苗的研究多集中在愈伤组织、不定芽增殖、生根苗移栽等方面[4，6,8]。而关于连续多代增殖培养过程中，杉木无性系组培不定芽质量衰退问题的研究尚未见报道。为此，本研究以广东省林业科学研究院选育的杉木无性系为材料，研究了培养基类型和植物生长调节剂配比方式对已多代增殖培养的不定芽萌发和生长的影响，以期为杉木无性系组培不定芽质量体系的建立提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以广东省林业科学研究院选育的杉木无性系T-c07采穗圃分株基部萌条为外植体，培育成组培苗。所育组培苗60 d为一个增殖培养周期，在第25个增殖培养周期末，选择叶色正常、长势一致的无菌不定芽为试验材料。

1.2 试验方法

采用正交设计L16(45)安排试验(见表1)，观测6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和基本培养基4个因素(分别用A、B、C、D表示)4个水平(不考虑交互作用)对杉木T-c07 无性系已多代培养的组培不定芽增殖和质量的影响，以筛选出优化的增殖培养基配方。表1列出的所有培养基统一添加30g·L-1蔗糖，6.80 g·L-1卡拉胶，pH值 5.8。在超净工作台上，采用单芽接种的方式，将选取出的无菌不定芽剪切为2.0 cm长并且带顶梢部分，然后接种到表1所示的16种培养基中。每种培养基接种10瓶，每瓶接种8个不定芽，3次重复，接种后，芽苗转入培养室中培养。培养室温度控制在(25±2)℃，相对湿度50%～60%，每天光照时间13 h。进行验证试验时，以正交试验筛选出的优化培养基与未优化前的培养基进行比较，其中优化前的培养基为DCR+0.90mg·L-16-BA+0.01mg·L-1NAA+0.10mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+6.80g·L-1卡拉胶。

表1 植物生长调节剂种类及组合Tab.1 Types and combinations of plant growth regulators(mg·L-1)试验号ABCD10.1000MS20.100.050.013/4MS30.100.100.05DCR40.100.200.103/4DCR50.3000.01DCR60.300.0503/4DCR70.300.100.10MS80.300.200.053/4MS90.5000.053/4DCR100.500.050.10DCR110.500.1003/4MS120.500.200.01MS130.7000.103/4MS140.700.050.05MS150.700.100.013/4DCR160.700.200DCR

1.3 数据收集

在接种后第60天时，从每个处理中随机抽取3瓶试验苗进行观测，指标包括每个培养瓶的萌芽率、每个不定芽的萌芽数量、芽长及芽鲜重，然后以各试验号各性状指标的平均值进行统计分析。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2013软件进行统计分析。增殖倍数即为不定芽的平均萌芽数量，萌芽率的计算方式如下：

(1)

2 结果与分析

2.1 培养基类型对不定芽萌发的影响

由正交试验极差分析结果可知(见表2)，各因素对萌芽率和增殖倍数两个性状指标影响的主次顺序分别为B>A>C>D和A>B>C>D，表明NAA浓度(B)、6-BA浓度(A)对已经过多代增殖培养的T-c07 杉木无性系不定芽萌发具有关键作用，其次是IBA浓度(C)，影响较小的是基本培养基类型(D)。对两个性状指标在四个因素不同水平下的平均值进行比较可知，提高萌芽率和增殖倍数的理论最优组合分别为A4B2C1D2、A4B2C2D2和A1B2C2D3。

表2 优化不定芽萌发的正交试验结果Tab.2 The orthogonal test results of optimized adventitious buds germination(mg·L-1)性状指标各水平平均值和极差ABCDk180.2197.9296.8893.75k294.7910096.8896.88萌芽率/%(χ1)k395.8392.7190.6392.71k497.9278.1384.3885.42R17.7121.8812.5011.46k11.582.572.172.12k22.382.602.362.16增殖倍数/倍(χ2)k32.341.891.912.27k42.222.082.081.97R0.800.700.460.30 注:表中k1～k4分别指各因素四个水平下试验观测值的平均值,R指各因素四个水平下试验观测值的极差。下同。

2.2 培养基类型对不定芽生长的影响

由表3极差分析结果可知，四个因素对不定芽的长度和鲜重影响的主次顺序分别为B>D>A>C和B>A>D>C，表明NAA浓度(B)是影响不定芽生长的主要因素，其次是6-BA浓度(A)和基本培养基类型(D)，IBA浓度(C)的影响相对较小。对两个性状指标在四个因素不同水平下的平均值进行比较可知，采用A1B2C1D3组合将获得最优芽长，A4B1C2D1组合将获得最优的芽鲜重。

表3 优化不定芽生长的正交试验结果Tab.3The orthogonal test results of optimized adventitious buds growth性状指标各水平平均值和极差A/(mg·L-1)B/(mg·L-1)C/(mg·L-1)Dk12.15 2.02 2.08 1.91 k22.09 2.19 2.03 1.99 芽长/cm(χ3)k31.88 1.97 1.99 2.18 k41.93 1.88 1.96 1.98 R0.26 0.31 0.12 0.27 k11.17 2.26 1.62 1.80 k21.76 1.86 1.68 1.60 芽鲜重/g(χ4)k31.57 1.34 1.37 1.55 k41.79 0.82 1.60 1.33 R0.62 1.44 0.31 0.47

2.3 优化增殖培养基的综合评选

由表4可知，不定芽萌发和不定芽生长指标的优化条件并不一致，需进行各因素的综合评选。再结合表2、表3的结果可知，因素A是增殖倍数(χ2)的主要影响因子，取A2水平时，可获得最高的萌芽数量，同时萌芽率(χ1)、芽长(χ3)、芽鲜重(χ4)三个性状指标相比各自的最优值减幅较小，分别为3.20%、2.79%和1.68%，因此，A因素取A2水平。因素B是χ1、χ3、χ4的主要影响因素，是χ2的次要影响因素，取B1水平时，χ1、χ2、χ3比取B2水平时有小幅降低，减幅分别为2.08%、1.20%、7.76%，χ4则增长明显，增幅为21.51%，取B2水平时则相反，因此，因素B取B1水平更适宜。因素C是四个性状指标的第三或第四影响因子，取C2时，χ1、χ2、χ4可获得最优值，χ3取C1水平时减幅不明显，仅为0.02%，因此，C因素取C2水平适宜。对于因素D，其对χ3的影响较大，为第二影响因素，对其余指标的影响较小，为第三或第四影响因素，取D3时，χ2、χ3均能获得最优值，χ1、χ4减幅较小，因此，D因素取D3水平适宜。由此可知，T-c07 杉木无性系优化增殖培养的最优组合为A2B1C2D3，即DCR+0.30mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1IBA，同时添加30 g·L-1蔗糖、6.80 g·L-1卡拉胶。

表4 各性状指标的影响因素主次顺序Tab.4 The ranking of influencing factors of observed indexes性状指标因素主次顺序优化水平组合萌芽率(χ1)B>A>C>DA4B2C1D2A4B2C2D2增殖倍数(χ2)A>B>C>DA2B2C2D3芽长(χ3)B>D>A>CA1B2C1D3芽鲜重(χ4)B>A>D>CA4B1C2D1

2.4 验证试验

根据正交试验结果，对筛选出的优化增殖配方(A2B1C2D3)，即DCR+0.30 mg·L-16-BA+0.01mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+6.80 g·L-1卡拉胶进行验证。按照前文所述试验材料和试验方法，将T-c07 杉木无性系的无菌不定芽分别接入增殖优化培养基和优化前的培养基中。经过60 d的培养，统计不定芽萌发及生长情况(见表5)。优化后的增殖培养基，不定芽的萌芽率仍然达到100%，增殖倍数为3.25倍，芽长2.23 cm，芽鲜重2.57 g，较之优化前的培养基有所提高，增幅为4.69%～5.52%，但不定芽长势得到明显改善，表现出叶片舒展、叶色嫩绿、苗干健壮的形态特征(见图1)。由此可知，正交试验筛选出的最优组合(A2B1C2D3)更适合已经多代增殖培养的T-c07 杉木无性系组培不定芽的萌发和生长，正交试验结果是可靠的。

表5 最优组合和优化前的增殖培养基不定芽萌发和生长情况Tab.5 The germination and growth of adventitious buds with optimal combination and non-optimized proliferation medium配方号萌芽率/%萌芽数量/个芽长/cm鲜重/g颜色长势最优组合(A2B1C2D3)1003.252.232.57嫩绿健壮优化前增殖培养基1003.082.132.45黄绿弱小

3 结论与讨论

植物生长调节剂是通过人工合成的，具有与植物内源激素类似功能的活性物质[9]，目前，已被广泛应用于植物组织培养过程中，是不定芽诱导和组织器官分化的关键因素。已有的研究表明，适宜浓度的植物生长调节剂可以诱导组培材料不定芽或不定根的萌发和生长[10]。其中，NAA、IAA、IBA都属于生长素类似物，对不定芽的生长起到促进作用[11]。6-BA是人工合成的细胞分裂素，可以促进非分化组织分化以及不定芽的形成[12]。陈振科等[13]研究指出，培养基中添加0.30 mg·L-1IBA能有效促进红心杉C.lanceolata增殖不定芽的高生长，添加0.80 mg·L-16-BA则能显著提高茎段增殖系数。胡燕梅等[10]研究发现，培养基中添加1.00 mg·L-16-BA和0.20 mg·L-1NAA时，丽格海棠begonia×elatior不定芽增殖的茎段生长较快，芽苗叶子舒展、颜色嫩绿，而培养基中只添加0.10 mg·L-1NAA时能快速诱导不定根的形成。本研究表明，优化前和优化后的增殖培养基，植物生长调节剂的种类和配比方式均有改变。优化后的增殖培养基，未添加NAA且6-BA和IBA浓度均明显降低，两者的比率则明显提高。优化后增殖培养的不定芽增殖倍数略提高，芽苗长势得到明显改善。由此表明，植物生长调节剂的种类以及浓度和配比方式不同时，不定芽的增殖效果会产生较大差异。此外，本研究所获优化增殖培养基与相关学者对杉木增殖培养的研究结果不同[6-8，13]，这可能是由于不同树种、同一树种的不同品系或同一品系的不同组织器官对不同植物生长调节剂的生理响应措施不同所致。

植物内源激素对不定芽的生长和发育起着主要的调控作用[14]。外源植物生长调节剂的添加可引起植物内源激素水平的变化，进而调节植物形态的发生过程[15-16]。王京伟等[15]研究指出，在添加了1.00 mg·L-16-BA和1.00 mg·L-16-BA+0.10mg·L-1NAA植物生长调节剂的培养基上，野生山丹Liliumpumilum小鳞茎内源玉米素核苷(ZR)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)含量有不同程度的下降，说明植物生长调节剂刺激了小鳞茎内源激素的减少，进而表现出不同的形态特征。张莉[16]对杂种落叶松Larchgmelinii10 ×Larchkaempferi13和长白落叶松Larixolgensis的组织培养发现，在不定芽增殖的不同阶段，内源激素的含量差异极显著，不定芽增殖培养基中添加TDZ、6-BA、NAA等植物生长调节剂后，两种落叶松的内源IAA、ABA含量普遍升高，ZT、GA3含量相对降低，进而在不同程度上影响了不定芽的萌发和生长。本研究显示，优化后的增殖培养基，降低了6-BA和IBA含量，同时未添加NAA，这可能是因为在多代增殖培养过程中，不定芽组织中可能积累了一定的植物内源激素，而且在不定芽萌发和生长过程中，内源IAA含量可能已处于较高水平，因而，增殖培养基中适当降低植物生长调节剂的添加浓度，同时减少生长素类似物的含量，可能正好符合已多代增殖培养的不定芽萌发及生长所需，因而能够获得较理想的增殖效果。但由于在组织培养的不同阶段，不定芽组织中的内源激素浓度水平可能存在较大差异，因而需要在适宜的时期添加适量浓度的植物生长调节剂，才有可能与内源激素产生协同作用，但内源激素的含量与外源植物生长调节剂添加的定量关系，还有待进一步研究。由此也推测，多代增殖培养后不定芽质量衰退可能也与植物内源激素的变化有关。因此，在进行杉木无性系组织培养时，还应该及时进行材料的复壮或更新。

此外，除了植物生长调节剂外，影响不定芽质量的因素还可能与培养时的温度、湿度等有关。同时，由于此研究只是1个继代周期的观测结果，优化的增殖培养基对杉木组培不定芽质量的持续影响还需进一步观测。